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第一部分母亲妊娠前高雄出生子代随访、印迹基因表达及甲基化状况目的:观察母亲妊娠前高雄出生子代的生长发育及幼年期血压、血脂、血糖情况,研究子代糖代谢相关印记基因表达差异及甲基化改变,评估母亲高雄对子代表型及表观遗传的影响。材料和方法:对2002-2008年在浙江大学医学院附属妇产科医院诊断为高雄激素血症并妊娠成功的患者进行随访,其子代作为实验组,根据其妊娠方式(自然妊娠,促排卵后妊娠,IVF-ET后妊娠)进行匹配,以同期正常自然妊娠或因男性/管性因素经促排卵或IVF-ET后出生子代为对照组,比较分析两组子代围产期情况,生长发育指标,血糖(空腹,口服糖耐量试验OGTT)、血脂及血压水平。利用荧光定量PCR检测子代外周血糖代谢相关父/母源性印记基因表达,利用亚硫氢酸盐测序的方法检测差异表达基因差异甲基化区域(DMR)的甲基化水平。同时收集临床废弃人卵母细胞,体外高雄激素处理后采用免疫荧光检测卵母细胞母源性印迹基因IGF2表达改变。结果:1.本研究共随访80名母亲高雄出生子代及146名对照组子代,高雄子代出生体重、孕周、早产率较对照组均无显著性差异;2.随访时两组子代的年龄、体重指数(BMI)、血压及血脂水平均无显著性差异,母亲高雄出生子代的空腹血糖(4.72±0.04mmol/L vs.4.60±0.03mmol/L,p<0.05)、空腹胰岛素(3.58±0.18μU/ml vs.3.12±0.15μU/ml,p<0.05)及 HOMA 胰岛素抵抗指数(0.76±0.04 vs.0.66±0.03,p<0.05)均显著高于对照组;3.其中74名高雄组子代及66 名对照组进行了 OGTT,两小时血糖(5.12±0.13mmol/Lvs.4.85±0.15mmol/L,p<0.05)及胰岛素水平(10.53±2.03μU/mlvs.4.72±1.08μU/ml,p<0.01)高雄子代均显著高于对照子代;4.高雄子代外周血淋巴细胞母源性印记基因IGF2及GRB10的表达显著增高,其相应差异甲基化区显著低甲基化;体外雄激素处理后,卵母细胞IGF2表达显著升高。结论:母亲妊娠前高雄出生子代幼年期空腹及糖耐量试验中糖/胰岛素水平均发生改变,但随访中未发现血糖/胰岛素异常的子代;糖代谢相关印记基因IGF2及GRB20表达增高可能与高雄子代糖代谢水平改变有关,甲基化水平降低为印记基因表达上调的机制,提示母亲高雄影响子代表观遗传。第二部分妊娠前高雄大鼠子代表型、亲代卵母细胞及子代胰岛Igf2表达及甲基化检测目的:研究妊娠前高雄大鼠子代的糖/胰岛素代谢状况,评估高雄致子代糖尿病的风险;研究高雄对亲代卵母细胞及子代胰岛中印迹基因Igf2表达及甲基化水平的影响,明确表观遗传改变的传代效应。材料与方法:建立雌性高雄激素大鼠模型,交配前(6周龄)检测血睾酮及游离雄激素指数。7周龄将高雄雌鼠与正常雄鼠交配得到高雄组子代,同龄正常雌鼠与正常雄鼠交配得到对照组子代。检测两组子代的出生体重、幼年期(3周龄)及成年期(8周龄)体重、日能量消耗及饮水量,血糖仪检测空腹血糖并行糖耐量试验,ELISA试剂盒检测胰岛素水平。分离纯化大鼠子代胰岛细胞和亲代MII期卵母细胞,实时定量PCR检测印记基因表达,亚硫酸氢盐测检测IGF2差异甲基化区甲基化状态。结果:1.母亲妊娠前高雄出生子代的出生体重于对照组相比无显著性差异;2.高雄子代自幼年期出现日饮水量增多及日能量消耗增多,且这一表型一直持续至成年期;3.高雄子代空腹血糖显著高于对照组,并且有27%在幼年期即出现糖尿病(GTT30min血糖>11.1mmol/L)。发育至成年期,虽然高雄子代的空腹血糖与对照组相比无显著性差异,但在GTT30min及60min时,其血糖水平仍显著高于对照组,且76%的成年高雄子代仍表现出糖尿病;4.高雄子代幼年期空腹及注射葡萄糖后的胰岛素水平均显著低于对照组,成年期空腹胰岛素与对照组无显著性差异,然而注射葡萄糖后其胰岛素水平仍显著低于对照子代;5.高雄子代胰岛细胞Igf2较对照组显著高表达,且胎鼠胰岛中Igf2DMR2甲基化水平显著降低;6.高雄亲代卵母细胞Igf2同样高表达,Igf2DMR2甲基化水平也显著低于对照组,更有趣的是,亲代卵母细胞中3个低甲基化的CpG位点与子代胎胰岛细胞的3个低甲基化CpG位点相对应。结论:1.大鼠母亲妊娠前高雄致子代糖尿病;2.妊娠前高雄出生子代胰岛素释放功能受损,是导致子代糖尿病的主要原因;3.高雄子代胰岛印记基因Igf2表达异常,可能是其胰岛细胞功能不良的机制之一;4.高雄子代胰岛Igf2DMR2甲基化水平降低,为Igf2表达升高的机制;5.妊娠前高雄暴露致卵母细胞Igf2表达及甲基化水平改变,这种异常的表观遗传修饰可从亲代卵母细胞(配子)传递至子代胰岛细胞(体细胞),是母亲高雄致子代糖代谢异常的主要机制之一。第三部分高雄激素对甲基转移酶3a表达的调控目的:研究雄激素对甲基转移酶3a(DNMT3a)表达的调控,从体内及体外细胞培养两个方面探讨雄激素调节DNMT3a表达的分子机制。材料与方法:获取高雄激素造模的大鼠MII卵母细胞,采用免疫荧光比较高雄状态下的卵母细胞与正常卵母细胞DNMT3a表达的差异;体外实验以人原代颗粒细胞及人KGN颗粒细胞为研究对象,通过不同浓度的双氢睾酮(DHT)处理,以及雄激素受体(AR)小干扰RNA处理细胞后再加入不同浓度DHT处理,采用实时定量PCR及Western技术分别检测颗粒细胞中DNMT3a mRNA和蛋白水平的表达改变;在KGN颗粒细胞系中应用实时定量PCR及Western检测不同浓度DHT对转录因子STAT3的调节,并利用染色质免疫共沉淀技术,明确DNMT3a DNA上是否存在STAT3反应元件,进一步确定其结合位点。结果:1.在体实验显示,高雄大鼠卵母细胞中DNMT3a与对照组相比显著低表达;2.体外细胞实验显示,DHT可浓度依赖性的下调原代颗粒细胞DNMT3a mRNA,同时上调印记基因IGF2 mRNA;相应地,DHT可在mRNA水平浓度依赖性的下调KGN细胞DNMT3a的表达;SiRNA敲减AR可阻断DHT对DNMT3a的下调作用;3.DHT可浓度依赖性降低STAT3的表达;4.DNMT3a转录起始位点上游-1118bp处存在着STAT3的结合位点。结论:1.体内高雄可降低大鼠卵母细胞甲基化建立关键酶DNMT3a的表达,这可能是高雄激素干扰卵母细胞母源性印记的建立过程,从而导致其印记基因IGF2甲基化水平降低、表达上调的重要机制;2.人颗粒细胞体外实验显示高雄激素从mRNA及蛋白水平下调DNMT3a的表达,且这一调控是通过雄激素受体通路来进行的;3.DNMT3a启动子区存在转录因子STAT3的反应元件,高浓度雄激素下调STAT3蛋白可能是其从mRNA 转录水平降低DNMT3a表达的机制之一。