研究背景:胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在我国其死亡率居恶性肿瘤首位.进展期胃癌的预后很差,复发和转移是胃癌患者预后差和导致患者死亡的根本原因.淋巴结转移是胃癌转移的甲.期事件,也是胃癌预后的独立因素,因此研究淋巴道转移的分子机制对于临床肿瘤患者的诊治具有十分重要的意义.肿瘤的侵袭转移受多种因素调控,是多种生物分子和信号通路相互作用的复杂的生物学过程.传统的研究方法一次只能检测一个或几个基因,很难诠释肿瘤侵袭转移的全部过程.DNA微阵列是最有效的检测肿瘤基因差异表达谱的技术之一,它对于探讨胃癌发生、发展及转移的分子机制,寻找胃癌早期诊断、判断预后的分子标记物和临床治疗靶点具有非常重要的意义. 研究目的：本研究采用基因表达谱芯片技术比较正常胃粘膜(非肿瘤组织)、胃癌原发灶和胃癌淋巴结转移灶的基因表达谱,旨在筛选与胃癌发生和淋巴结转移的相关基因,为进一步阐明胃癌发生和淋巴道转移的分子机制、评估胃癌病人预后和实施个体化治疗奠定实验基础. 方法：应用TRIzol法分别提取正常胃粘膜(A组)、胃癌原发灶(B组)和胃癌淋巴结转移灶(C组)组织的总RNA,用HPLC纯化T7-(d7)24 primer反转录合成双链cDNA,经Phase Lock Gel fPLG)一酚氯仿纯化后,以三种组织的cDNA为模板,应用Affymetrix公司的BioArray High Yield RNA Transcript Labelingkit进行体外反转录,同时进行生物素标记,合成生物素化的cRNA探针.合成好的cRNA探针质控合格后经片段化处理(大小约50-200bp之间),分别在Affymetrix公司的专用设备Affymetrix<○R>Ftybridization Oven 640中与Affymetrix Genechip HG-U133A2.0(包括22,277个转录本,对应于约20,247个人已知基因和1475个EST)杂交16小时,杂交后的芯片经过洗脱、染色处理,使用Affymetrix<○R>Scanner3000 7G对杂交信号进行扫描,芯片扫描后获得的数据利用Affymetrix<○R>GCOS software进行计算处理.在比较两组芯片的结果之前,先对每张芯片的数据进行归一化处理.以Signal Log Ratio≥1.0或≤-1.0(表明转录木的水平至少提高或降低2倍)和Change p-value(代表了两张不同芯片之间一个探针对表达水平相同或不同的可能性)≤0.05(表明比较的结果有统计学意义)作为筛选差异表达基因的标准,并用生物信息学对检测结果进行分析.为确保芯片检测质量,Affymetrix基因芯片内还设有GAPDH等看家基因作为对照,以及BIOB,BIOC、.BIOD和CRE等外加的阳性对照以检测基因芯片的质量.应用实时荧光定量PCR(Real time-PCR)定量检测6个已知基因(COLlA2,SPPl,PTGDS,RAC2,TFFl,CXCR4)在三种组织的表达情况,以验证基因芯片的检测结果. 结果：基因芯片检测报告表明,这三张芯片的背景值和噪音值都很均匀,其中看家基因GAPDH的5＇端和3＇端的信号比值分别是1.26,1.05,1.17,均显著低于3.0的标准值;外加的阳性对照BIOB、BIOC、BIOD和CRE也被检测到,并且信号强度随着浓度由低到高呈现由弱到强的趋势,表明芯片质量良好,杂交及检测体系正常,芯片检测结果真实可信.在总共22,277个转录本中,A组检测到10,930个,占总转录本的49.1﹪:B组检测到12353个,占总转录本的.55.50﹪;C组检测到11825个,占总转录本的53.1﹪.进一步利用Affymetrix公司的GCOS分析软件对三组样品的芯片检测结果进行分析,并根据筛选标准筛选差异表达基因,结果发现B组(原发灶)同A组(正常胃粘膜)相比,B组表达上调转录本1052个,其中已知基因转录本761个,EST、291,表达下调的转录本1301个,其中已知基因转录本810个,EST、491个;C组同B组比较,表达上调的转录本1708个,其中已知基因转录本1005个,EST703个.本文只列出了各组差异表达基因最显著的前60个基因.根据GO(Gene Ontology)分类和聚类分析,按照其参与的生物学过程(Biological Process)和分子功能(Molecular Function)进行了初步的功能分类.在这些差异基因中,胃癌原发灶上调基因的功能主要集中在细胞周期、细胞生长增殖、细胞移动和粘附以及肿瘤基质重塑与降解等方面,卜调基因的功能主要集中在胃肠道对外源性生物的代谢、正常的消化功能、免疫防御、细胞粘附(粘蛋白为主)等方面;胃癌淋巴结转移灶上调基因的功能主要集中在细胞粘附、信号转导、蛋白质合成与分解、细胞趋化和移动以及细胞周期等方面;下调的基因功能主要集中在物质转运、质白质等大分子代谢、细胞粘附、免疫反应与防御等方面,反映了胃正常代谢、消化功能减退,防御保护功能削弱.同时我们通过生物信息学相关分析软件(队列试验的基因表达谱分析、基于Gene Omology分类的集群分析和Pathway分析)对实验数据进行挖掘,结果显示A、B、C组连续下调的基因表达的主要趋势(具有显著性,P小于0.05)集中于糖类(包括多糖)代谢、上皮组织发育、以及细胞粘附等方面.A、B、C组连续上调的基因表达变化趋势(具有显著性,P小于0.05)集中于免疫反应、细胞粘附、细胞运动、细胞周期及调亡相关基因.通过Pathway分析发现,整合素介导的细胞粘附信号通路中的THBSl、TLN、CAPN9、ITGAX和TGF信号通路中ENG、INHBA、Smad6和STAT1等基因在A、B、C三组呈梯度改变,提示这些基因在胃癌转移过程中可能起着重要作用. 结论： 1.利用基因芯片筛选胃癌及转移相关基因是一个高效、快速的方法. 2.本实验结果显示胃癌组织呈高增殖状态、粘附和移动活跃、细胞周期和细胞粘附信号通路可能异常激活;间质呈高反应状态,细胞外基质重塑和降解活跃;而胃正常的生物性代谢、消化功能紊乱,胃粘膜保护抗御功能被削弱. 3.淋巴结转移灶上调的基因主要集中在免疫反应、细胞粘附、细胞运动、细胞周期和凋亡相关基因,下调的基因主要集中在代谢、细胞粘附,这些基因有可能在胃癌淋巴结转移中起到促进或抑制作用,其中TGF-β信号通路和整合素介导的细胞粘附信号通路可能被异常激活.