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Micro RNAs(mi RNAs)是一组内源性基因表达调控因子,自发现至今,已经成为肿瘤研究领域的新热点。随着生物信息学和分子生物学技术的不断发展,部分mi RNAs的功能也逐渐得到确认。研究发现一部分异常表达的mi RNAs与乳腺癌的远处转移有着密切的关系,其中mi R-335(micro RNA-335)表达缺失,提示预后不良。故本论文主要研究mi R-335对具有高转移性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231的生物学特性的影响及其与预测靶基因C-met靶向关系的验证。第一部分Mi R-335对MDA-MB-231乳腺癌细胞生物学特性的影响目的:检测mi R-335在乳腺癌细胞系BT474、T47D、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231和正常乳腺上皮细胞MCF-10A中的表达以及在原发性乳腺癌和淋巴结转移性乳腺癌组织中的表达情况,进一步研究mi R-335对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响。方法:采用荧光实时定量PCR检测mi R-335在乳腺癌细胞系BT474、T47D、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231和正常乳腺上皮细胞MCF-10A中的表达情况以及在原发性乳腺癌和淋巴结转移性乳腺癌组织中的表达情况。体外培养MDA-MB-231细胞并将其分3组,分别为mi R-335组、阴性对照组和空白对照组。mi R-335组转染mi R-335模拟物(has-mi R-335 mimics),阴性对照组转染阴性对照序列(negative control,NC),空白对照组细胞不行任何转染。通过MTT实验检测过表达mi R-335对细胞增殖能力的影响;流式细胞仪检测过表达mi R-335对细胞凋亡的影响;Transwell实验检测过表达mi R-335对细胞迁移能力的影响。Western blot检测MMP-2和MMP-9的蛋白表达情况。结果:各乳腺癌细胞系中mi R-335表达水平均低于正常乳腺上皮细胞MCF-10A,MDA-MB-231细胞中最低(P<0.01)。在随机配对的10例原发性乳腺癌和10例淋巴结转移性乳腺癌标本中,有7例淋巴结转移性乳腺癌中Mi R-335的表达低于对应的原发性乳腺癌(P<0.05)。过表达mi R-335对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、凋亡无明显影响(P>0.05),但能显著抑制细胞的迁移能力(P<0.05)。Western blot结果显示:mi R-335组MMP-2和MMP-9的蛋白的表达量均低于阴性对照组和空白对照组。结论:mi R-335在高转移性乳腺癌细胞系和淋巴结转移性乳腺癌组织中明显低表达,过表达mi R-335对MDA-MB-231细胞的增殖、凋亡无明显影响却抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力。mi R-335可能通过下调MMP2和MMP9的表达从而抑制MDA-MB-231细胞迁移。第二部分mi R-335与C-met靶向关系的验证目的:通过对Mi R-335与C-met靶向关系的验证进一步研究其在乳腺癌细胞中具体作用机制。方法:Pic Tar(www.pictar.org)、Targetscan数据库(www.target scan.org)预测mi R-335可能靶基因。荧光定量PCR及WB检测mi R-335、c-Met在乳腺癌各细胞系和正常乳腺上皮细胞中的表达。构建靶基因荧光报告载体,BT20、MDA-MB-231细胞共转染野生型c-Met 3’UTR荧光素酶报告载体、突变型c-Met 3’UTR荧光素酶报告载体和mi R-335 mimics、mimics control,转染后分别分为c-Met 3’UTR-wt组和c-Met 3’UTR-mut组并经荧光素酶报告基因检测测定活性,BT20、MDA-MB-231细胞分别转染mi R-335 mimics、mimics control和m i R-335 ASO、ASO control后通过Western blot蛋白水平检测评估cMet表达情况。结果:Targetscan数据库预测显示C-Met的3’UTR区存在mi R-335的可能结合位点。荧光定量PCR及WB结果显示:各乳腺癌细胞系中,c-Met在BT-20、MDA-MB-231细胞中的蛋白表达水平明显升高,而在正常乳腺上皮细胞MCF-10A和其他乳腺癌细胞系中蛋白表达水平相对较低。相反,mi R-335在BT-20、MDA-MB-231细胞中的RNA表达水平降低,在正常乳腺上皮细胞MCF-10A和其他乳腺癌细胞系中RNA表达水平升高。荧光素酶报告基因检测结果显示:BT-20、MDA-MB-231细胞中,c-Met 3’UTR-wt组中转染mi R-335 mimics的细胞较转染mimics control的细胞相对荧光强度明显降低,c-Met 3’UTR-mut组中转染mi R-335 mimics的细胞与转染mimics control的细胞相对荧光强度无明显变化。Western blot结果显示mi R-335 mimics组较mimics control组蛋白表达水平降低,mi R-335 ASO组较ASO control组蛋白表达水平升高。结论:乳腺癌各细胞系中mi R-335 m RNA水平表达和c-Met蛋白水平表达呈负相关,mi R-335能够与c-Met m RNA 3’UTR区特异性结合并抑制其表达,mi R-335在翻译后修饰水平调控c-Met的表达。综上所述,本实验通过生物信息学及细胞生物学技术验证了mi R-335与c-Met的靶向关系。