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UDP-半乳糖4-异构酶(EC 5．1．3．2，Gal．E)来自 Eschericia coli K-12，催化 UDP-半乳糖与 UDP-葡萄糖之间的相互转化反应。对本实验室保存的 DH5 α(pET15b/Gal E)进行培养，提取质粒pET15b/Gal E，用Gal E两端特异性的引物进行PCR扩增，扩增后的片断双酶切，然后与商业化的载体pYD1质粒连接，转化大肠杆菌top1.0， Amp筛选阳性克隆并用双酶切和PCR初步鉴定重组质粒pYD1/Gal E，基因测序验证后转化进入酿酒酵母细胞 Saccharomyces cerevisiaeEBY100，用YNB-葡萄糖转化培养基筛选。阳性转化子经菌落PCR鉴定，进一步通过免疫荧光试验证明UDP-半乳糖4-异构酶已经成功的锚定在EBY100酵母细胞表面。UDP-半乳糖4-异构酶将通过酵母菌的分泌系统和 Agal-Aga2 融合蛋白自动连接到酵母菌细胞壁上，实现UDP-半乳糖4-异构酶的表达—纯化—固定一步化。含2﹪葡萄糖的YNB-CAA(0.67﹪YNB；0.5﹪Casamino acids) 培养基培养含有Gal E的重组酵母菌EBY100，当菌体浓度达到OD<,600>=2.0时，转接到含有2﹪半乳糖的YNB-CAA培养基中，使OD<,600>=0.5；20℃诱导培养Gal E在酵母菌表面表达。表面表达时，不同蛋白诱导时间不同，本试验中诱导时间过短(如<24h)细胞的培养液OD<,600>偏小，菌液太稀；时间过长(如>36h)，培养液OD<,600>变化不大，菌液泛黄，所以采用诱导30h。分别用0.6mM UDP-半乳糖、0.6mM UDP-葡萄糖做底物与酵母细胞(干重约10mg)组成5ml体系，24℃反应。反应结束后，煮沸离心，取上清毛细管电泳进行酶活测定。结果显示：表达在酵母表面的Gal E蛋白在催化UDP-半乳糖与UDP-葡萄糖之间的相互转化时具有很高的活性，以UDP-半乳糖作为底物反应速度较快，达到反应平衡仅需要3 min；相比大肠杆菌表达的UDP-半乳糖4-异构酶(达到反应平衡需要15 min)活性高。
实验表明：已经成功地在酿酒酵母表面锚定了高活性的UDP-半乳糖4-异构酶，这样避免了在大肠杆菌表达时的复杂纯化步骤。通过大量的培养酵母细胞获得比较纯的酶，并且能实现酶的反复利用，大大降低了成本，有利于工业化生产。
N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetylglucosaminyl transferase；chitinsynthase；NodC)属于糖基转移酶家族Ⅱ，是所有根瘤菌合成根瘤因子使豆类植物生成根瘤进行固氮所必需的酶，负责合成根瘤因子即脂壳寡糖的骨架部分。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶反应条件非常温和，底物分别为糖基供体IJDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)，糖基受体N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，产物为N-乙酰氨基葡萄糖的聚合体，聚合度一般为2-5即为(GlcNAc)<,2-5>。在体外表达N-乙酰氨基葡萄糖转移酶可以大量合成寡糖骨架，促进根瘤因子的生产，从而可以应用于豆类等植物的根部促使根结瘤固氮提高产量。另外N-乙酰氨基葡萄糖转移酶与其他的酶偶联可以应用于寡糖的合成，所以在生物固氮及糖生产工业方面具有重要的意义。但是N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是一个跨膜蛋白，在大肠杆菌中表达量低、很难纯化和重建它的活性，这就大大限制了N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的应用及对酶反应机制的研究。
本论文研究的目的基因N-乙酰氨基葡萄糖转移酶来自于中华百脉根瘤菌，已经克隆在pET28a质粒上，形成pET28a/NodC，保存于大肠杆菌DE3中(本实验室存放)。根据软件分析从N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的基因序列推断蛋白质序列，以pET28a/NodC中的全序列NodC为模板，设计特异性引物，利用PCR技术将疏水区的N-端1-21个氨基酸及C-端的跨膜区删除，保留酶的第22至第290个氨基酸，其中包含了酶的催化活性区段(第53-第224个氨基酸)。这样使N-乙酰氨基葡萄糖转移酶即具有催化活性又能以可溶性的形式存在，大大提高酶的表达量。将PCR扩增后的DNA片段NodC-tru经双酶切后与载体pET22b质粒进行连接，然后导入大肠杆菌DH5α，用Amp筛选阳性克隆并用菌落PCR、双酶切和基因测序鉴定重组质粒pET22b/NodC-tru。通过摸索培养和IPTG诱导条件的试验，发现无论以低温、长时间、低浓度IPTG诱导还是高温、高浓度IPTG、快速诱导，NodC-tru基因在大肠杆菌内表达的删减N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 (NodC-tru蛋白) 主要以包涵体存在，在菌体细胞破碎后的上清液中也有，但是表达量少。为了得到NodC-tru蛋白，我们对包涵体用6mol/L的盐酸胍进行变性处理，并随之进行复性。复性后的蛋白溶液通过超滤除盐和一定量的浓缩，然后透析将原来的缓冲液更换为酶反应的缓冲液，冷冻浓缩后进行酶的活性测定。将诱导结束后的1L OD<,600>=1.61菌液得到的NodC-tru蛋白，加入底物UDP-GlcNhc、GlcNAc，在20℃，pH7.0条件下反应2h，液相色谱检测后初步证明NodC-tru蛋白有活性。实验结果表明我们已经可以获得有活性的缺少跨膜区和N-端疏水区NodC-tru蛋白，与生产全序列的NodC蛋白相比，提高了表达量，并且大大降低了纯化和重建酶活性的难度，有利于将来的大规模工业化生产。