论文部分内容阅读
鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的一种鸡的高度接触性传染病。该病在世界范围内广泛传播,造成鸡群的免疫抑制、生产性能的下降和疫苗的免疫接种失败,对养禽业造成了严重的威胁和巨大的经济损失。特异性、快速、简便的核酸检测方法有利于对该疾病进行早期诊断,促进早期干预和防控,对于降低该疾病的传播和减少养禽业的经济损失具有重要意义。此外,特异、快速、简便的核酸检测方法也是有效预防控制规模化生产中疫病问题及食品检疫的一种重要手段,对食品安全来说也具有重要意义。迄今为止,已经有许多检测方法用于IBDV的检测,但是现有的检测方法存在着这样或那样的缺点,如操作步骤复杂、反应时间长、易导致假阳性、灵敏度低、检测特异性差、依赖昂贵的设备和专业人员等,无法满足IBDV的高效检测。近年来,随着对CRISPR-Cas基因编辑系统的深入研究和对一些Cas蛋白的非特异性切割活性的发现,基于RNA引导的CRISPR-Cas的核酸检测方法在快速、高效、特异的核酸检测方面显示出巨大潜力,开启了分子诊断的新时代。所以,在本研究中我们基于CRISPR-Cas12a系统的非特异性单链DNA切割活性,结合了RPA技术（重组酶聚合酶扩增,一种等温扩增技术）,通过在检测体系中添加由荧光基团和猝灭基团修饰的单链DNA报告基团,建立了一种IBDV的可视荧光检测方法。本研究的主要内容分为以下三个部分:（1）Cas12a蛋白的表达、纯化及活性鉴定。将重组质粒p ET28-6×His-MBP-TEVhu Lb Cas12a转化大肠杆菌Rosetta（DE3）、BL21Star（DE3）以及BL21（DE3）,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定,结果表明,重组Cas12a蛋白在大肠杆菌中获得高效表达。针对IBDV的保守区,共设计了三条cr RNA,并筛选出了最佳的cr RNA,初步建立了IBDV的CRISPR-Cas12a检测方法。将原核表达的重组Cas12a蛋白替换CRISPRCas12a检测系统中商品化的Cas12a蛋白,结果表明,原核表达的重组Cas12a蛋白能特异性识别IBDV序列,并可非特异性切割荧光标记的单链DNA报告基团（FQ-ss DNA）,产生特异性荧光。（2）基于RPA-CRISPR-Cas12a检测IBDV的可视荧光方法的建立及评估。首先,建立了IBDV的RPA检测方法。然后,通过优化适用于RPA扩增和CRISPR-Cas12a实验的缓冲体系,成功地将RPA扩增和基于CRISPR-Cas12a系统的可视荧光检测结合在一个单一的检测体系中,并利用单一的反应条件来检测IBDV。该方法的检测只需要在37℃条件下反应50 min便可以完成,通过紫外光或者蓝光可以观察到检测结果。我们将该方法命名为“RPA-Cas12a DS”。最后,用建立的RPA-Cas12aDS来检测IBDV和禽的其它病原,并采用RT-PCR方法作为标准对照来评估其特异性。结果显示,该方法对IBDV的检测具有良好的特异性,检测结果与RT-PCR相一致。进一步对RPA-Cas12a DS方法检测IBDV的灵敏度进行评估,用Real-time PCR（q PCR）方法作为对照。结果显示,RPACas12a DS检测下限为277个拷贝,而q PCR检测下限的值为616个拷贝。说明RPACas12a DS方法的检测灵敏度要优于IBDV的q PCR检测方法,其检测灵敏度为q PCR的2倍左右。（3）RPA-Cas12aDS方法在临床及鸡肉检测中的应用。为了评估RPA-Cas12a DS方法在临床一线及食品检测中的效果,将RPA-Cas12a DS方法应用于IBDV临床样本诊断和鸡肉中IBDV的检测,同时用商品化的RT-PCR试剂盒检测作为对照。结果表明,RPACas12a DS方法与商品化的RT-PCR试剂盒具有良好的一致性,说明本研究建立的RPACas12a DS方法可用于IBDV的临床检测及鸡肉食品检测。综上所述,本研究通过将重组酶聚合酶扩增（RPA）与基于CRISPR-Cas12a的核酸检测相结合,建立了一种快速、简便、特异、可视化的IBDV检测方法,命名为“RPACas12a DS”。RPA-Cas12a DS对IBDV的检测可在37℃,50 min内完成,检测过程中避免了开盖造成的污染,检测结果可直接在蓝光或紫外光下观察到。整个检测过程不需要复杂的仪器设备,该方法具有在基层应用的潜力。此外,本研究将建立的鸡传染性法氏囊病病毒RPA-Cas12a DS检测方法应用于鸡肉的检测中,有助于提高鸡肉食品的生物安全性和强化食品生产规范。