研究背景心肌缺血性疾病是当今危害人类健康的主要疾病之一,人们通过溶栓、经皮冠脉血管成形术、冠脉搭桥术等手段使缺血心肌在短时间内恢复血供,改善心功能,但仍然不能避免缺血再灌注时组织损伤反而加重,甚至导致不可逆性的功能和器质性损伤的发生¹。心肌缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury,IR）的发生机制目前认为与自由基的作用、细胞内钙超载、白细胞的激活、内质网应激及线粒体功能障碍等有关,其中自由基活性氧分子（reactive oxygen species,ROS）损伤作用和线粒体功能障碍被认为是缺血再灌注损伤的重要环节2-3。自噬（Autophagy）是生物在进化过程中保留的一种特殊现象,是细胞在生存、发育、分化及代谢过程中的一种溶酶体降解途径,对物质及能量进行更新,来维持细胞功能和活性^4-5。缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）在缺氧状态下能被充分激活,HIF-1α是其活性亚基,能够稳定结合在靶基因低氧反应元件上的特异性蛋白,通过快速有效的转录和转录后调控,参与稳定细胞形态、血管形成以及铁、糖代谢和细胞生长增殖而产生适应性反应,尤其对于需氧量大的心肌细胞具有重要的保护作用⁶。通过对肿瘤细胞的研究发现,肿瘤细胞普遍处于缺氧状态,线粒体产生大量的ROS,ROS能够抑制HIF-1的降解,稳定HIF-1的活性⁷。HIF-1α能够活化BNIP-3和NIX,活化的BNIP-3和NIX与Bcl-2结合,释放Beclin-1诱导自噬产生,自噬和低氧相关分子信号通路不是单独存在,而是相互关联的⁸。心肌细胞通过自噬应对不良刺激,在心肌缺血阶段,自噬可以通过溶酶体降解受损的蛋白质和细胞器为细胞提供营养物质及能量来进行代偿;心肌缺血再灌注阶段,心肌细胞内ROS增加,ROS的积累可以使HIF-1α蛋白稳定存在,进一步通过Beclin-1途经诱导自噬,自噬可能通过清除被ROS损伤的细胞器和蛋白质,降低ROS对细胞的毒性伤害,保护细胞,还可能降解正常蛋白质和细胞器,导致细胞损伤,甚至自噬性死亡^9-10。HIF-1α和自噬在心肌缺血再灌注损伤中表达及作用的研究已经越来越深入,但二者之间关系的研究较少。杨曌等人利用体外氧糖剥夺模型观察脑缺血缺氧中HIF-1α对小胶质细胞自噬具有调节作用,HIF-1α表达量逐渐增加,自噬增加,并诱导小胶质细胞的死亡,阻断HIF-1α的表达,小胶质细胞自噬减少,死亡率降低¹¹。研究目的建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,观察缺血再灌注时自噬活性、HIF-1α蛋白表达情况;调节自噬强度,观察HIF-1α蛋白表达和心肌损伤情况;调节HIF-1α蛋白表达,观察自噬发生和心肌损伤情况,借此探讨心肌缺血再灌注损伤时HIF-1α和自噬之间可能的关系,以及对心肌细胞功能可能产生的影响,为临床治疗心肌缺血性疾病提供可能的理论基础。研究方法和结果一、大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的制备与验证1、大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的建立选择健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠,术前禁食12h,不禁水,10%水合氯醛30mg/100g腹腔注射麻醉,仰卧位固定,经口插管,呼吸机辅助呼吸。胸骨下段切口进胸,在心脏左心耳根部l² mm处,寻找辨认左冠状动脉前降支（LAD）,以双头6-0无损伤缝线带3mm×3mm涤纶垫片,在LAD下方水平褥式缝合,再穿同样大小垫片,双结结扎挤压垫片阻断冠脉血流,每个线结下置10号粗丝线产生活结作用,靠缓慢拉锯式牵拉丝线松解线结,恢复血流灌注^12-14。2、大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的验证将200-300g健康雄性SD大鼠随机分为5组,每组10只,按照上述方法建立动物模型,各实验组大鼠存活6-8只,死亡率28%,每组最终选取6只存活大鼠相关实验数据进行统计学分析。对照组（a组）,即假手术组:开胸后仅于心肌表面穿过缝线,不结扎LAD,观察120min取全血及切取左心室心肌组织;单纯缺血组（b组）:结扎LAD,不松结扎线,观察30min取全血及切取左心室心肌组织;再灌注60min组（c组）:结扎LAD30min,松开结扎线,恢复灌注60min取全血及切取左心室心肌组织;再灌注120min组（d组）:结扎LAD30min,松结扎线,恢复灌注120min取全血及切取左心室心肌组织;再灌注180min组（e组）:结扎LAD30min,松结扎线,恢复灌注180min取全血及切取左心室心肌组织。采用ELISA试剂盒测定血清cTnT含量,TTC、伊文氏蓝双染色估算心肌缺血和梗死面积,多通道生理记录仪监测心肌力学指标评价心肌收缩功能。结果:大鼠心肌缺血再灌注后血清cTnT含量、心肌缺血及梗死面积增加,心肌收缩功能进一步降低,再灌注120min时功能损伤最明显,再灌注180分钟时有所恢复。二、大鼠心肌缺血再灌注损伤时HIF-1α蛋白表达及自噬发生情况将200-300g健康雄性SD大鼠随机分为3组,每组选取6只存活大鼠相关实验数据进行统计学分析,手术操作同第一部分。对照组（A组）,即假手术组:开胸后仅于心肌表面穿过缝线,不结扎LAD,观察120min取全血及切取左心室心肌组织;单纯缺血组（B组）:结扎LAD,观察30min取全血及切取左心室心肌组织;缺血再灌注组（C组）:结扎LAD脉30min,松开结扎线,观察120分钟取全血及切取左心室心肌组织。采用western-blot方法检测各组心肌细胞HIF-1α蛋白和自噬相关蛋白Beclin-1的表达量,以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值表示自噬发生强度;RT-PCR方法检测各组心肌细胞HIF-1αmRNA和Beclin-1 mRNA表达量。结果:单纯缺血组心肌细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1和HIF-1α蛋白表达高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。缺血再灌注组心肌细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1和HIF-1α蛋白表达均较单纯缺血组进一步增加,差异有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关性分析检验缺血再灌注组心肌细胞HIF-1α和Beclin-1蛋白表达具有相关性,相关系数为0.730,P=0.000。缺血再灌注组心肌细胞Beclin-1和HIF-1αmRNA表达均高于单纯缺血组,差异有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关性分析检验缺血再灌注组心肌细胞HIF-1αmRNA和Beclin-1 mRNA表达具有相关性,相关系数为0.630,P=0.005。三、抑制自噬,大鼠心肌缺血再灌注损伤时HIF-1α蛋白表达及心肌损伤情况将200-300g健康雄性SD大鼠随机分为3组,对照组、缺血再灌注组和自噬抑制组,每组选取6只存活大鼠相关实验数据进行统计学分析,手术操作同第一部分。自噬抑制组动物在手术前腹腔注射自噬抑制剂6-氨基-3-甲基嘌呤（3-MA）,15mg/kg,每天一次,连续3天。对照组和缺血再灌注组大鼠腹腔注射同等体积的生理盐水,每天一次,连续3天。对照组（D组）,即假手术组:开胸后仅于心肌表面穿过缝线,不结扎LAD,观察120min取全血及切取左心室心肌组织;缺血再灌注组（E组）:结扎LAD30min,松开结扎线,观察120分钟取全血及切取左心室心肌组织;自噬抑制组（F组）:结扎LAD30min,松开结扎线,观察120分钟取全血及切取左室心肌组织。采用western-blot方法检测各组心肌细胞HIF-1α蛋白和自噬相关蛋白Beclin-1的表达量,以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值表示自噬发生强度;采用RT-PCR方法检测各组心肌细胞HIF-1αmRNA和Beclin-1 mRNA表达量;通过测定血清cTnT含量,TTC、伊文氏蓝双染色估算心肌缺血和梗死面积及心肌力学指标变化评价心肌损伤程度。结果:缺血再灌注组心肌细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。自噬抑制组心肌细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达均较缺血再灌注组降低,差异有统计学意义（P<0.05）,而Beclin-1 mRNA表达量与缺血再灌注组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。自噬抑制组心肌HIF-1α蛋白和HIF-1αmRNA表达量与缺血再灌注组比较差异无统计学意义（P>0.05）。自噬抑制组血清cTnT含量、心肌缺血和梗死面积均明显低于缺血再灌注组,心肌力学指标也优于缺血再灌注组,差异有统计学意义（P<0.05）。四、抑制HIF-1α蛋白表达,大鼠心肌缺血再灌注损伤时自噬发生及心肌损伤情况将200-250g健康雄性SD大鼠随机分为3组,对照组、缺血再灌注组和HIF-1α蛋白抑制组,每组10只,最终选取6只存活大鼠相关实验数据进行统计学分析,所有手术操作均同第一部分。HIF-1α蛋白抑制组动物在手术前30分钟腹腔注射HIF-1α蛋白抑制剂3-（5,-羟甲基-2,呋喃基）-1-苯甲基吲唑（YC-1）,终浓度为5μM,用量20mg/kg,对照组、缺血再灌注组大鼠手术前30分钟腹腔注射同等体积的生理盐水。对照组,即假手术组（Ⅰ组）:开胸后仅于心肌表面穿过缝线,不结扎LAD,观察120min取全血及切取左心室心肌组织;缺血再灌注组（Ⅱ组）:结扎LAD30min,松开结扎线,观察120分钟取全血及切取左心室心肌组织;HIF-1α蛋白抑制组（Ⅲ组）:结扎LAD30min,松开结扎线,观察120分钟取全血及切取左心室心肌组织。采用western-blot方法检测各组心肌细胞HIF-1α蛋白和自噬相关蛋白Beclin-1的表达量,以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值表示自噬发生强度;采用RT-PCR方法检测各组心肌细胞HIF-1αmRNA和Beclin-1 mRNA表达量;通过测定血清cTnT含量,TTC、伊文氏蓝双染色估算心肌缺血和梗死面积及心肌力学指标变化评估心肌损伤程度。结果:缺血再灌注组心肌细胞HIF-1α蛋白表达量高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。HIF-1α蛋白抑制组心肌细胞HIF-1α蛋白表达量较缺血再灌注组明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）,而HIF-1αmRNA表达量与缺血再灌注组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。HIF-1α抑制组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白低于缺血再灌注组,差异有统计学意义（P<0.05）而Beclin-1 mRNA表达量与缺血再灌注组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。HIF-1α抑制组相对心肌梗死面积高于缺血再灌注组,cTnT含量增加,心肌收缩功能减低,而心肌缺血面积却低于缺血再灌注组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:一、应用带垫片活结结扎大鼠左冠状动脉前降支,阻断30min,恢复灌注60-180min,再灌注120min时损伤效果最佳,手术操作简便,死亡率较低,可以成功制作大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。二、大鼠在心肌缺血再灌注损伤时自噬标志蛋白LC3显著增加,自噬增强,自噬相关蛋白Beclin-1及Beclin-1mRNA表达增加,自噬可能是依赖Beclin-1途径产生的。HIF-1α蛋白和HIF-1αmRNA表达明显增加,与Beclin-1在蛋白和基因水平上均显著正相关,HIF-1α作为缺氧应激反应中的中枢调控因子,可能通过Beclin-1途经对自噬产生一定的调节作用。三、应用腹腔注射自噬抑制3-MA,可以在蛋白水平有效抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤时的自噬强度,心肌损害减轻,心肌缺血及梗死面积降低。自噬在心肌缺血再灌注损伤时对心肌细胞产生了不利影响,抑制自噬可以对心脏功能起到一定的保护作用。大鼠心肌缺血再灌注损伤HIF-1α蛋白和HIF-1αmRNA表达在自噬水平有效抑制时无明显变化,自噬强度不影响HIF-1α蛋白和基因表达。四、腹腔注射HIF-1α抑制剂YC-1后HIF-1α表达在蛋白水平被有效抑制,自噬强度减低,HIF-1α对大鼠心肌缺血再灌注损伤中的自噬可能产生一定的调节作用。HIF-1α在大鼠心肌缺血再灌注损伤中对心肌细胞功能影响具有两面性。一方面,抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤HIF-1α蛋白表达,大鼠心肌梗死面积增加,心肌细胞收缩功能降低,心肌损伤加重,HIF-1α可以促进心肌细胞缺血缺氧条件下的活性,不依赖自噬途经对心肌细胞产生有利的影响;另一方面,HIF-1α参与诱导细胞自噬发生,依赖自噬途经对心肌细胞产生不利影响,抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤HIF-1α蛋白表达可以降低缺血区自噬强度,减少缺血区心肌细胞自噬性损伤,降低心肌缺血面积,对缺血区心肌细胞具有保护作用。