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荧光化学传感器(Fluorescent Chemosensor)的构建历来都是化学家们研究的重点,其研究和应用也已经取得很大的进展。测试条件由早期的有机溶液过渡到水溶液,甚至到体液;检测靶标由现实环境中的阴阳离子、小分子转换到生物体内的离子、小分子和大分子,甚至到检测生物体内的某一进程;检测技术从单一的荧光比色对照发展到细胞成像、时间分辨荧光分析技术,甚至与核磁共振成像和纳米材料相结合等。因此,利用荧光传感器检测生物体内小分子已成为研究的热点之一。小分子α-酮戊二酸是代谢途径中最重要的氮素运载体之一。氨基酸的氨基通过转氨基作用被结合到α-酮戊二酸上,并随着血液运输到肝脏,氮元素在肝脏中进入尿素循环,因此α-酮戊二酸是广泛存在于人体体液。据报道,小分子α-酮戊二酸作为一种潜在的生物标志物与众多疾病存在关联,而且目前也缺乏直接快速低成本高效率的检测血清中α-酮戊二酸的方法,所以引入荧光化学传感器实现血清中α-酮戊二酸的检测是本文的研究重点。 本研究主要内容包括:⑴合成一个基于苯并噻二唑的荧光分子(DT),其可以通过检测α-KA来间接监测AML的病情,同时经过一系列平行实验来优化荧光识别过程,包括溶剂选择性、环境因素、反应物浓度和响应速度等。优化后的实验结果显示,与未优化的实验结果相比,DT的荧光增加倍数有着非常明显的提升。此外,通过实验证明DT对α-KA具有很好的选择性相对于生物体内其它的羧基化合物,并且适合于血清中的α-KA的检测,展现了探针潜在的生物应用前景。由于通过优化使荧光产生的巨大增加(约61倍),荧光化学传感器(DT)展现出非常优秀的检测性能和巨大的应用价值。⑵设计了一种基于罗丹明和BODIPY单元的荧光共振能量转移(FRET)探针,通过将罗丹明与BODIPY的衍生物进行桥联,得到能够检测α-酮戊二酸的荧光比率型探针RDM-BO。后者是通过荧光素单元接入水溶性基团2-氯乙氧基-2-乙氧基二乙醇后改善整个分子的水溶性,使其在血清环境中反应效果更佳。研究表明,荧光化学传感器RDM-BO本身的荧光光谱与BODIPY单元类似,当探针与α-酮戊二酸发生反应时,RDM-BO中的罗丹明单元会发生开环反应,使分子的共轭发生变化,同时产生新的荧光峰,检测效果显著,检测限可达到3.14μM。RDMH同样利用罗丹明单元开环的原理检测α-KA,在pH为5.7的HEPES缓冲溶液中,反应时间为25 min,检测温度为37.5℃,RDMH的浓度为10μM,α-KA的浓度为0.1 M时,其荧光增加倍数接近10倍,检测限可达到6.75μM。⑶设计出了一套精准有效的定量检测人体血清中α-KA浓度的实验方案,其结果具有很好的重现性。采用优化后的实验方案,将RDMH用于13例正常人血清和101例各类肝病病人血清中α-KA浓度的测试,实验结果显示肝癌肝硬化病人血清中α-KA浓度显著高过正常人血清中α-KA浓度,而肝炎病人由于发病原因和种类过于复杂,其血清中α-KA浓度在5到20μM之间。通过总结经验性的实验结果,缩短血清测试的流程和分析测试数据,能够更加快速便捷高效地评估待检人员的身体健康状况,为血常规检测提供重要的参考信息。