论文部分内容阅读
背景:肺癌是最常见的恶性肿瘤,也是引起癌症死亡的主要原因。大约70%的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）确诊时为晚期。多数患者确诊时难以切除,其治疗主要依靠化疗与放疗相结合。然而,肿瘤的放射抵抗和放射治疗的副作用限制了其治疗效果和应用。联合应用放射增敏剂可提高其治疗潜力。丁酸钠（sodium butyrate,NaBt）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor,HDACi）,已被证明在多种癌症中抑制肿瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡,延缓肿瘤细胞的侵袭和转移。但它在NSCLC中的确切作用及其机制尚未阐明。目的:探讨HDACi NaBt对NSCLC A549细胞辐射敏感性的影响及其机制,并阐明MDM2/p53/p21信号通路在其中的作用。方法:1.干扰质粒构建及转染表达:构建p53-siRNA干扰质粒,转染至A549（p53野生型）细胞,得到A549（p53 KD）瞬时转染细胞株。2.CCK-8法:检测NaBt联合电离辐射对A549细胞增殖活性的影响,确定最佳NaBt浓度以及给药时间。3.克隆形成实验:沉默p53前后,检测NaBt联合电离辐射对A549细胞集落形成能力的影响。4.流式细胞术:检测NaBt单独或联合电离辐射作用后,A549细胞凋亡（Annexin V-FITC染色法）、Ca2+（Fluo-3AM探针）、ROS（DCFH-DA探针）、细胞线粒体膜电位（罗丹明123染色法）和细胞周期分布（PI染色法）的变化。5.免疫荧光法:检测细胞线粒体膜电位6.qRT-PCR方法:检测NaBt单独或联合电离辐射作用后,A549细胞凋亡和细胞周期相关基因的表达变化。7.Western Blot方法:检测NaBt单独或联合电离辐射作用后,A549细胞凋亡、细胞周期相关蛋白的表达变化以及转染siRNA-p53后的沉默验证。8.统计学分析:采用Graphpad prism7统计学软件,数据以均数±标准差（（?）±s）表示,多组间样本数据的比较采用单因素方差分析,两组间的样本均数比较采用独立样本t检验,P＜0.05被认为具有统计学意义。结果:1.NaBt联合电离辐射对A549细胞增殖能力的影响NaBt抑制A549（p53野生型）细胞增殖活力（P＜0.05或P＜0.01）,并呈浓度和时间依赖性,联合电离辐射进一步抑制细胞增殖（P＜0.05或P＜0.01）。NaBt单独或联合4 GyX射线作用于A549（p53 KD）细胞24 h后,在照射组中,沉默p53后与沉默前相比,细胞增殖率升高（P＜0.05）;在照射联合NaBt组中,沉默p53后与沉默前相比,细胞增殖率也有所升高（P＜0.05）。2.NaBt联合电离辐射对A549细胞集落形成能力的影响A549（p53野生型）细胞经过2、4、6、8 Gy照射后,与未照射组相比,集落形成数量减少,且随着剂量的增加,集落形成数量减少更加明显。联合NaBt后,集落形成数量与单纯照射组相比具有明显的减少趋势。A549（p53 KD）细胞沉默p53后经过2、4、6、8 Gy照射与未沉默p53经过2、4、6、8 Gy照射相比,集落形成数量明显增加;沉默p53后,照射联合NaBt组集落形成数量与未沉默p53照射联合NaBt组相比,也有明显的增加趋势。3.NaBt联合电离辐射对A549细胞凋亡的影响NaBt单独或联合4 GyX射线作用于A549细胞（p53野生型）24和48 h后,各组凋亡率与对照组相比均明显降低,且二者联合作用的凋亡率明显高于各自单独使用时的凋亡率（P＜0.01）。NaBt单独或联合4 GyX射线作用于A549细胞（p53 KD）24 h后,在对照组、4 Gy X射线照射组、以及10 m M NaBt联合4 Gy X射线照射组中,沉默p53后与沉默前相比凋亡率均下降（P＜0.05）。4.NaBt对电离辐射诱导的A549细胞ROS的影响NaBt单独或联合4 GyX射线照射均引起A549细胞ROS水平升高（P＜0.01）,且联合组升高更明显。5.NaBt联合电离辐射对A549细胞线粒体膜电位的影响NaBt单独或联合4 GyX射线照射均引起A549细胞线粒体膜电位降低（P＜0.05或P＜0.01）,且联合组降低更明显。6.NaBt联合电离辐射对A549细胞Ca2+生成的影响NaBt单独或联合4 GyX射线照射均引起A549细胞Ca2+升高（P＜0.01）,且联合组升高更明显（P＜0.01）。7.NaBt联合电离辐射对A549细胞周期的影响NaBt单独作用引起A549细胞G1期阻滞,电离辐射单独作用或联合NaBt引起G2期阻滞,且联合组更加明显（P＜0.01）。且NaBt单独或联合电离辐射均引起周期相关蛋白Cyclin B的基因和蛋白表达量表达降低,且联合组降低更明显。8.MDM2/p53/p21通路在NaBt对A549细胞辐射敏感性影响中的作用NaBt单独或联合4 GyX射线照射能有效激活A549细胞中p53,影响p53调控基因的转录,包括使细胞周期调节因子p21表达增加和MDM2表达降低,最终导致细胞周期阻滞引起细胞调亡,从而提高NSCLC A549细胞辐射敏感性。结论1.NaBt单药可以抑制A549细胞增殖活性、升高ROS水平、降低线粒体膜电位、增加Ca2+的浓度、引起G1期阻滞并诱导凋亡。2.NaBt可能通过线粒体凋亡途径增强A549细胞的辐射敏感性。3.MDM2/p53/p21通路在NaBt辐射增敏过程中发挥重要作用。