华蟾素是我国传统中药材中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)阴干皮经提取加工制成的灭菌水溶液,在我国广泛应用于肝癌等多种恶性肿瘤的治疗。原发性肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率逐年呈上升趋势,严重威胁着人类的健康。寻找高效、低毒副作用的药物用于原发性肝癌的防治有着重大的临床意义。临床研究表明,华蟾素对预防和治疗原发性肝癌具有较好的疗效,在预防乙型肝炎向原发性肝癌转变、稳定或部分缩小肝癌病灶、减轻不良反应和提高患者生活质量等方面发挥着独特的优势,其抗肿瘤作用主要与诱导细胞凋亡有关。然而,华蟾素的化学成分相对复杂,抗肿瘤机制亦不明确。因此,进一步分离、纯化其有效活性成分,并阐明其作用机制,对于提高华蟾素临床用药的准确性,以及开发新型抗肿瘤药物均具有重大的意义。鉴于此,本研究在前期华蟾素抗肿瘤研究的基础上,采用活性追踪分离的方法,从华蟾素中筛选鉴定出两种具有抗肝癌活性的蟾蜍二烯酸内酯类化合物,华蟾蜍精(cinobufagin)和脂蟾蜍配基(resibufogenin),通过体内、外实验对活性相对较好的华蟾蜍精的抗肿瘤活性及作用机制进行了初步研究,并且测定了华蟾素中这两种蟾蜍二烯酸内酯类化合物的含量；另外,对蟾皮超临界CO2萃取物体外抗肝癌的活性及作用机制进行了初步探讨。本研究旨在为华蟾素进一步的临床应用及相关抗肝癌药物的开发及临床应用提供实验基础。1华蟾素抗肝癌有效成分的筛选和鉴定目的：筛选和鉴定华蟾素中抗肝癌的有效成分。方法：采用活性追踪分离的方法对华蟾素中抗肝癌的有效成分进行筛选。采用MTT法对不同组分抑制HepG2细胞增殖的活性进行测定。活性组分用部位分离、硅胶柱层析、制备型TLC以及HPLC进行提取分离。采用NMR和EI-MS技术鉴定活性化合物的结构。结果：通过一系列的活性追踪分离实验,从华蟾素中分离获得两个具有抗肿瘤活性的有效组分,经TLC和HPLC检测证实其为两个纯度较高的化合物。通过将1HNMR、13CNMR、DEPT及EI-MS的结果与现有数据库及已发表文献相关数据进行比对,最终将两个化合物分别鉴定为华蟾蜍精和脂蟾毒配基。结论：采用活性追踪分离等方法,从华蟾素中筛选鉴定出两个具有抗HepG2细胞增殖作用的活性化合物,华蟾蜍精和脂蟾毒配基。2华蟾蜍精体外抗肝癌活性及作用机制研究目的：对华蟾蜍精抑制HepG2细胞增殖及诱导细胞凋亡的机制进行研究。方法：采用MTT法对华蟾蜍精和脂蟾毒配基抑制HepG2细胞增殖的作用进行测定。采用Hoechst 33258染色和PI染色的方法对华蟾蜍精诱导HepG2细胞凋亡的作用进行研究。采用Western blotting的方法对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9的表达进行检测。结果：在0.0001 mg/mL-100mg/mL的浓度范围内,华蟾蜍精和脂蟾毒配基均有抑制HepG2细胞生长的作用,且呈现出明显的时间和剂量依赖性。作用24 h、48 h、72 h,华蟾蜍精对HepG2细胞的IC50分别为0.56μg/mL、2.29 x 10"3μg/mL和1.02x10-3μg/mL;而脂蟾毒配基对HepG2细胞的IC50分别为6.95μg/mL、3.59μg/mL和3.15μg/mL。Hoechst 33258染色及PI染色的结果表明,华蟾蜍精在体外具有明显的诱导HepG2细胞凋亡的作用,表现为染色质固缩、细胞核出现致密浓染或碎块状致密浓染等,0.04 gg/mL的华蟾蜍精作用HepG2细胞24 h后,其凋亡率为22.24%。Western blotting的结果显示,蟾蜍精体可以使细胞凋亡相关因子Bcl-2的蛋白表达下调,而Bax、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达上调。结论：华蟾蜍精具有明显的体外抑制HepG2细胞增殖的作用,作用机制与诱导细胞凋亡有关,受凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9调控。3华蟾蜍精对裸鼠人肝癌移植模型抗肿瘤作用的研究目的：通过建立裸鼠人肝癌(HepG2)移植模型,探讨华蟾蜍精体内抗肿瘤的活性及诱导细胞凋亡的机制。方法：采用肝癌细胞(HepG2)皮下注射法,建立裸鼠人肝癌移植模型。待肿瘤长至约100 mm3时,将40只模型裸鼠随机分为大、中、小剂量组(华蟾蜍精给药组)、阳性对照组(ADM组)和阴性对照组(NS组),每组8只。通过观察荷瘤裸鼠食欲、精神状况及体重变化情况,对药物的毒性进行评价。通过测定给药期间裸鼠肿瘤体积变化,对药物抗肿瘤的活性进行评价。采用HE染色法,观察裸鼠人肝癌移植模型治疗后肿瘤的坏死程度。采用TUNEL染色法观察检测了裸鼠人肝癌移植模型治疗后细胞凋亡的情况。采用Western blotting的方法检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9的表达情况。结果：通过将人肝细胞癌HepG2细胞接种于裸鼠腋窝皮下,成功建立了裸鼠人肝癌(HepG2)移植模型,造模成功率>95%,然后分组给予不同的药物处理。ADM组对人肝癌移植模型裸鼠具有一定的毒副作用,而华蟾蜍精0.5 mg/kg、1 mg/kg及1.5 mg/kg组均无明显毒副作用。华蟾蜍精在毒性较小的情况下,对裸鼠人肝癌移植模型的肿瘤生长具有一定的抑制作用,且呈剂量依赖性。华蟾蜍精能明显的诱导HepG2细胞凋亡,TUNEL染色法结果显示华蟾蜍精0.5 mg/kg、1.0 mg/kg和1.5 mg/kg组的凋亡指数分别为：6.2±1.04、8.8±1.04、13.4±1.68,且呈剂量依赖性。Western blotting结果显示蟾蜍精体可以使细胞凋亡相关因子Bcl-2的蛋白表达下调,Bax, Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达上调。结论：华蟾蜍精对裸鼠人肝癌移植模型具有明显的抗肿瘤作用,作用机制与诱导细胞凋亡有关,受凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9调控。5华蟾素抗肿瘤有效成分的含量测定目的：测定华蟾素中华蟾蜍精和脂蟾毒配基的含量。方法和结果：建立了HPLC测定华蟾素中华蟾蜍精和脂蟾毒配基的方法,色谱条件为C-18色谱柱(Waters, COSMOSIL Cholester,4.6 mm x 150 mm,5μ),流动相为乙腈/水(45:55),检测波长296 nm,流速1mL/min,柱箱温度40℃,上样量10μL,在此条件下,两峰的分离度>1.5。对上述测定方法的线性关系、精密度、稳定性和加样回收率进行了检测,结果表明华蟾蜍精、脂蟾毒配基在相关浓度范围内线性关系良好,浓度测定值的RSD分别为1.22%和0.73%,供试品溶液在常温条件下24 h内相对稳定,平均加样回收率分别为98.2%(RSD=1.76%)和100.8%(RSD=2.61%),均符合检测要求。采用上述色谱条件分别对3个不同批次的华蟾素浓缩液进行了检测,以外标法计算3批样品中华蟾蜍精和脂蟾毒配基的含量,结果显示3批华蟾素中华蟾蜍精和脂蟾蜍配基的含量存在较大的差异,推测可能与华蟾素浓缩液储存过程中的稳定性或华蟾素浓缩液的质量稳定性有关。结论：建立了一种简便、精确、回收率较好的测定华蟾蜍精和脂蟾毒配基含量的方法。通过测定,不同批次华蟾素中有效成分的含量存在一定的差异。6蟾皮超临界CO2萃取物SCE-TS体外抗肝癌活性及作用机制研究目的：对SCE-TS抑制HepG2细胞增殖及诱导细胞凋亡的机制进行研究。方法：采用高效液相色谱法测定了SCE-TS中华蟾蜍精和脂蟾蜍配基的含量,以外标法对其中华蟾蜍精和脂蟾毒配基的含量进行计算。采用MTT法对华蟾素和SCE-TS抑制HepG2细胞增殖的作用进行测定。采用Hoechst 33258染色和PI染色的方法对SCE-TS诱导HepG2细胞凋亡的作用进行研究。采用Western blotting的方法对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9的表达进行检测。结果：SCE-TS中华蟾蜍精和脂蟾蜍配基的含量分别为334.3μg/mL和1211.7gg/mL,明显高于华蟾素。华蟾素和SCE-TS均能显著抑制HepG2细胞的增殖,且呈现出明显的时间和剂量依赖性。作用24 h、48 h、72 h,华蟾素对HepG2细胞的IC50以生药蟾皮计分别为9.310 mg/mL、.122 mg/mL和0.033 mg/mL;而SCE-TS对HepG2细胞的IC50以生药蟾皮计分别为0.026 mg/mL、.012 mg/mL和0.011 mg/mL,表明等量蟾皮提取获得的SCE-TS中抑制HepG2细胞生长有效成分的含量明显高于华蟾素。SCE-TS具有明显的体外诱导HepG2细胞凋亡的作用,0.001 mg/mL、.01 mg/mL SCE-TS作用48 h后,HepG2细胞的凋亡率分别为18.45%和26.95%,呈剂量依赖性。Western blotting结果显示蟾蜍精体可以使细胞凋亡相关因子Bcl-2的蛋白表达下调,Bax、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达上调。结论：SCE-TS具有明显的体外抑制HepG2细胞增殖的作用,作用机制与诱导细胞凋亡有关,受凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9调控。