冠状病毒(Coronaviruses)是一类有包膜的单正链RNA病毒,能够感染人及其他哺乳动物和鸟类,导致支气管炎、肺炎、胃肠炎、肝炎和脑膜炎等疾病。鼠冠状病毒又称鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus, MHV),主要感染实验小鼠,是致病性和分子生物学得到广泛研究的冠状病毒原型之一。MHV S (Spike)蛋白是一种大小为180kDa的N-糖基化蛋白,在病毒感染过程中发挥重要作用。S蛋白可分为大小接近的两个部分,N-端部分S1主要识别受体,决定了病毒的宿主特异性。C-端部分S2包括膜外区、跨膜区和膜内区三部分：膜外区主要行使膜融合功能；跨膜区有膜锚定作用；而膜内区功能目前仍未完全清楚,主要影响S蛋白的装配、膜融合等功能。鼠冠状病毒S蛋白膜内区均包含一个半胱氨酸富含区(cysteine-rich domain, CRD),该区域部分缺失突变导致病毒形成多核巨细胞病变(syncytium)能力急剧下降,但不严重影响病毒的复制。本论文在此基础上,深入研究了该区域半胱氨酸残基在病毒复制、蛋白棕榈酰化修饰、蛋白转运与定位中的作用,从而了解Ⅰ型病毒跨膜蛋白膜内区结构与功能问的关系。RNA定向重组技术的建立利用冠状病毒RNA易发生同源重组的特点及S蛋白具有严格的细胞感染特异性建立了RNA定向重组技术。将突变引入DI RNA衍生质粒pMH54的相应位点并转录为mRNA,电转染被带有猫冠状病毒(FIPV)S基因膜外区的母本病毒(fMHV)感染的猫FCWF细胞,产生的重组病毒用小鼠L2细胞筛选并进一步用单斑法纯化,最后突变用RT-PCR和测序鉴定。同时,由于MHV基因2和4对病毒在培养细胞中的复制是非必需的,能被外源基因替换,因此外源膜蛋白HK基因和非膜蛋白EGFP基因也被引入重组病毒中。本论文制备了三个系列的重组MHV,包括S基因突变体、S基因突变加EGFP替代突变体、以及表达重组HK蛋白的突变体。前二者用于观察S蛋白膜内区突变对病毒复制的影响,EGFP用来提高重组病毒检测的灵敏性或作蛋白表达的对照。后者用于重组蛋白高效表达,验证真核载体表达相应蛋白的功能及研究病毒蛋白的装配功能。S蛋白膜内区缺失突变对外源蛋白表达的影响为了分析病毒在CRD缺失突变后对其上下游基因功能的影响,同时确定EGFP能否提高重组病毒产生的检测灵敏性,构建了四种重组病毒,包括替换了非必需基因2的MHV-HK,替换了非必需基因4的MHV-EGFP, S蛋白膜内区缺失突变体MHV-SACR,以及同时包含以上三个突变位点的MHV-H/S/G.结果显示四种重组病毒在小鼠成纤维细胞L2上的病毒滴度与野生型MHV无明显差异,其中重组MHV-HK和MHV-EGFP的病变、噬斑大小和形态与野生型MHV无明显差异,而MHV-SACR和MHV-H/S/G的噬斑较野生型MHV变小。同时,四种突变体均能够有效表达外源蛋白,亦能感染其它小鼠来源细胞(NIH/3T3和Neuro-2a),但易感性及蛋白表达水平低于L2细胞。此外,重组病毒能够将表达的外源蛋白定位在相应的细胞组分,与真核表达载体pIRES2-EGFP表达的相应蛋白完全一致：EGFP为全细胞分布,而HK定位在膜结构中。以上结果表明,部分缺失S蛋白膜内区可降低鼠冠状病毒的细胞致病性,同时不影响外源蛋白表达。S蛋白膜内区半胱氨酸残基在鼠冠状病毒复制中的作用将S蛋白膜内区的半胱氨酸进行缺失突变或1-2个残基的定点突变发现,任何单个的半胱氨酸残基的点突变都不会影响病毒的产生,而包含多个半胱氨酸的缺失突变会造成病毒致死或噬斑减小。因此对病毒复制的影响可能是由多个残基同时发挥作用,尤其是靠近膜边界部分的半胱氨酸。为了验证这一推测,构建了该区域半胱氨酸残基数量不等(从1个到6个)并带有EGFP报告基因的突变体。结果显示,半胱氨酸残基数量与重组病毒的产生成正相关：当2个以下的半胱氨酸残基时,不能形成重组病毒；3个时有少量重组病毒产生,4个有中度重组病毒产生,5至6个能较好的产生重组病毒,并且有轻度的多核巨细胞形成。这一结果与点突变和分段缺失突变结果非常一致。免疫荧光激光共聚焦发现此区域部分缺失突变导致S蛋白在细胞膜上的分布减少。用羟胺处理蛋白样品分析其电泳迁移率的变化显示,此区段只有2个半胱氨酸时不发生了棕榈酰化,而有6个半胱氨酸发生的修饰水平与野生型一样。此外,重组蛋白的棕榈酰化水平与其定位至脂筏的能力是一致的。综上所述,冠状病毒S蛋白膜内区单个的半胱氨酸对重组病毒产生没有明显的作用,需要3个或3个以上的半胱氨酸才发挥作用。可以假设这种作用的发挥与半胱氨酸的棕榈酰化修饰有关,修饰有助于S蛋白运送至细胞膜,并定位至脂筏结构。S蛋白在细胞表面聚集,促使感染细胞与邻近正常细胞发生融合,导致了多核巨细胞病变的发生。