人轮状病毒(Human Rotavirus, RV),是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一,其主要感染小肠上皮细胞,从而造成细胞损伤,引起腹泻。轮状病毒每年在夏秋冬季节流行,并在世界范围内造成大量婴幼儿死亡病例。目前尚无针对轮状病毒引起的腹泻的有效治疗手段,因而采用疫苗预防婴幼儿感染是目前的主要手段。目前国内外的上市轮状病毒疫苗均为减毒轮状病毒疫苗,在预防RV的感染过程中发挥了一定的作用,但也存在引发肠套叠、毒力返祖及外源因子污染等问题。肠道病毒71型(Human Enteroirus71, EV71), EV71是引起婴幼儿手足口病(Hand-Foot And Mouth Disease, HFMD)的主要病原体之一,多发生于5岁以下儿童,可引起手、足、口腔等部位的疱疹,少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等并发症甚至导致死亡。EV71灭活疫苗的研发过程中,存在着高保护效力高遗传稳定性毒株筛选等问题,目前国内外有数个EV71灭活疫苗项目正在进行临床试验。EV71减毒活疫苗的研发过程中出现遗传不稳定及引发个别并发症问题。综上,本实验拟通过构建同时包含RV及EV71主要抗原表位的亚单位疫苗,并通过免疫刺激最终对RV及EV71起到一定的保护作用。轮状病毒VP4蛋白作为轮状病毒的主要结构蛋白,决定轮状病毒的血清P型,主要具有与细胞受体结合并穿透细胞、血凝反应等功能,并能决定轮状病毒的毒力,引起较强的中和反应。VP4或其亚片段能刺激有效的免疫反应产生,因而VP4特别适合用于亚单位疫苗的研究。该蛋白在胰蛋白酶的作用下可裂解为VP5和VP8两个肽段。目前主要鉴定出的VP4中和抗原表位肽大都集中在氨基端的VP8肽段。EV71基因组为单股正链RNA,基因组全长约7500bp,编码一个开放阅读框,翻译约2200个氨基酸的前体蛋白,前体蛋白可水解为VP1、VP2、VP3、VP4四个结构蛋白并包装病毒颗粒,其中除VP4位于病毒颗粒内侧外,VP1-3三个结构蛋白均暴露于病毒颗粒表面,EV71VP1蛋白作为EV71的结构蛋白,具有EV71主要的抗原决定簇,是病毒主要的中和决定因子。基于轮状病毒及肠道病毒71型的以上特点,结合文献、蛋白质二级结构、亲疏水性与抗原表位分布的软件分析预测,本实验选取约800bp左右包括VP8全长与VP5部分片段的基因片段的VP4*片段及EV71VP1全长用于重组嵌合蛋白的构建。本实验共设计RV VP4*、EV71VP1、RV VP4*-EV71VP1、EV71VP1-RV VP4*四个实验组,结合分析软件结果,预期RV VP4*-EV71VP1实验组能保持较稳定的蛋白质结构并起到较好的免疫效果。前期大肠杆菌BL21株pET20b/30a/pthio原核表达实验结果提示,通过原核表达途径不能够较好的获得预期的四个实验组蛋白,结合文献资料与实验分析推测原因如下：1、RV VP4*蛋白具有细胞毒性,会阻碍大肠杆菌的正常表达和生长,2、选取的原核表达系统缺少这两个蛋白的个别稀有密码子,3、mRNA高级结构或会阻碍目的蛋白的翻译。鉴于重新选取目的基因片段的难度和时间问题,故决定采用腺病毒表达系统构建包含目的蛋白的重组腺病毒。后期实验包装并获得了具有RV VP4*、EV71VP1、RV VP4*-EV71VP1、EV71VP1-RV VP4*目的蛋白片段的四个重组腺病毒,感染重组腺病毒的细胞总RNA RT-PCR实验结果及免疫荧光实验证明,四个重组腺病毒均能较好的转录和翻译目的基因。经过传代获得初步纯化的重组腺病毒并进行了动物实验,动物实验结果表明,四个重组腺病毒均能刺激机体产生相对应的特异性抗体。目前实验未能发现含有目的基因的重组腺病毒所刺激产生的抗血清具有对EV71及RV的保护作用,推测因为免疫试验动物的病毒滴度不高及实验重复次数较少等原因造成,因此含有目的基因的重组腺病毒对于EV71及RV的中和保护作用尚不能定论,需做进一步的研究。在比较两种表达系统优异性及分析比对多个动物实验数据组的过程中,为未来的轮状病毒及肠道病毒71型基因工程联合疫苗研发工作提供了一定启示和思路。