【摘 要】
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东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch, BmK)抗神经兴奋肽Ⅲ(anti-neuroexcitation peptide, ANEPⅢ),具较好的抗惊厥、抗癫痫作用,极有可能成为脑神经兴奋疾病防治药物。目前,
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东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch, BmK)抗神经兴奋肽Ⅲ(anti-neuroexcitation peptide, ANEPⅢ),具较好的抗惊厥、抗癫痫作用,极有可能成为脑神经兴奋疾病防治药物。目前,利用转基因植物生产药用外源蛋白已经成为低成本大规模进行生物药物研究的主要途径之一。且该生物活性肽属于昆虫抑制型毒素,将其转化至植物中不仅可利用转BmK ANEPⅢ植物生产活性蛋白且使其具有抗虫害特性。本研究以植物双元表达载体pBin438为母核,利用分子克隆技术构建含有CaMV DE35S启动子、Ω′序列、5’端含有Kozak序列和3′端含有内质网滞留肽(ER retention signal)SEKDEL编码序列的ANEPⅢⅢ目的基因、NOS终止子表达盒,获得重组植物表达载体pBin-ANEPⅢ和pBI121-ANEPⅢ;用液氮冻融法和电击法转化根癌农杆菌EHA105,获得植物遗传转化工程菌pBin-ANEPⅢ/EHA105、pBI121-ANEPⅢ/EHA105。利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草和番茄叶片外植体,在选择培养基上进行抗性筛选,经过分化、壮大、生根等不同条件培养基培育,获得烟草和番茄抗性植株。利用PCR、RT-PCR、Western blotting方法验证,证明ANEPⅢ基因已经整合进烟草和番茄的基因组,并在抗性植株细胞内成功转录、表达BmK ANEPⅢ蛋白。利用荧光免疫技术定量检测转基因烟草和番茄中目的蛋白分别占总可溶性蛋白的0.81%和1.08%。该研究为进一步改良植物表达载体,获得高表达量抗神经兴奋肽,利用植物表达体系高效表达药用外源蛋白奠定一定的技术基础。
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