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赤藓糖醇(Erythritol),学名1,2,3,4-丁四醇,是一种新型甜味剂和食品添加剂,具有吸湿性小,热稳定性好,抗龋齿等优点。目前,发酵生产赤藓糖醇主要以蔗糖、葡萄糖、粮食类淀粉质为主要原料,原料成本较高且易导致粮食安全问题。甘油作为一种非粮碳源已被广泛应用于多种高附加值产品的发酵生产。但甘油具有较高的渗透压,高渗抑制细胞生长并导致赤藓糖醇生产强度较低,该问题严重制约以甘油为底物发酵生产赤藓糖醇。本研究以一株以葡萄糖为底物的非传统酵母Yarrowia lipolytica为出发菌株,通过高效的可视化诱变选育方法筛选出耐甘油高渗菌株,对甘油高渗培养基进行系统优化并建立了赤藓糖醇高渗发酵动力学模型,进而提出一种两阶段渗透压控制补料分批发酵高产赤藓糖醇策略,并对Y.lipolytica高渗响应机制进行了蛋白组学及转录水平研究。主要研究结果如下:(1)耐甘油高渗高产赤藓糖醇菌株诱变选育对一株以葡萄糖为碳源的Y.lipolytica CICC 1675进行ARTP和DES复合诱变处理,并结合高效的可视化TTC高渗筛选方案,从500株初筛菌株中筛选得到一株耐甘油高渗高产赤藓糖醇突变株Y-07,菌体量为12.8 g·L–1,赤藓糖醇产量为43.5 g·L–1,得率Yp/s为0.36 g·g–1,分别比出发菌株提高了91.0%,217.5%,71.4%,且遗传性状稳定。初步确定了突变株Y-07的最适发酵条件:甘油200 g·L–1,尿素1.68 g·L–1,酵母膏0.5 g·L–1,玉米浆0.5 g·L–1,CaCl2·2H2O 500 mg·L–1,ZnSO4·7H2O 100 mg·L–1,MnSO4·4H2O 10mg·L–1,FeSO4·7H2O 100 mg·L–1,MgSO4·7H2O 500 mg·L–1,KH2PO4 0.2 g·L–1,pH 3.0,种龄24 h,接种量10%(v·v–1),装液量20/250 mL。最终赤藓糖醇产量为69.4 g·L–1,Yp/s为0.37 g·g–1,生产强度P为0.41 g·L–1·h–1,分别比出发菌株提高263.4%,60.9%,272.7%。(2)Y.lipolytica发酵甘油产赤藓糖醇培养成分优化及高渗发酵动力学建立利用Plackett-Burman实验设计确定甘油、尿素、NaCl为赤藓糖醇产量的显著影响因素,利用3因素5水平的中心组合实验(CCD),构建了响应面(RSM)及人工神经网络(ANN)模型以预测最优显著因素组成,并比较了两模型预测精确性。结果表明ANN具有更精确的模型预测能力。利用遗传算法(GA)寻求ANN模型最优解,结果发现当甘油232.39 g·L–1,尿素1.57 g·L–1,NaCl 31.03 g·L–1时,赤藓糖醇最大预测产量为110.7g·L–1,实验验证产量为109.2 g·L–1。根据赤藓糖醇发酵不同阶段的发酵特性,利用Logistic和Luedeking-Piret方程结合Andrews及Bajpai模型构建了多阶段赤藓糖醇分批发酵动力学模型,该模型对菌体生长(X),底物甘油消耗(S)和赤藓糖醇生成(P)具有良好的预测和拟合能力,模型拟合值与实验值相关系数分别为0.981,0.994和0.992。为高渗环境下赤藓糖醇发酵过程提供了可视化的理论依据,为渗透压控制补料发酵策略建立提供动力学理论基础。(3)两阶段渗透压控制补料分批发酵生产赤藓糖醇研究渗透压显著影响菌体生长及多元醇合成模式。总糖醇得率及rE/M随体系渗透压的升高而增加,且赤藓糖醇产量随渗透压提升更为显著,NaCl可抑制甘露糖醇生成,最大菌体量随渗透压的提升而降低。赤藓糖醇发酵最适渗透压为4.17 osmol·kg–1。高渗显著促进赤藓糖还原酶(ER)的比酶活,而甘露糖醇-1-磷酸脱氢酶(M-1-PDH)被严重抑制。为进一步提升赤藓糖醇产量及生产强度,一种两阶段渗透压控制补料分批发酵策略被成功运用,甘油不仅作为底物还作为渗透压调节剂被利用。菌体生长阶段维持体系渗透压为4.25 osmol·kg–1,132 h以后控制体系渗透压为4.94 osmol·kg–1以维持全程高产物生成速率dpery/dt。最终赤藓糖醇产量为194.3 g·L–1,生产强度为0.95 g·L–1·h–1,分别比单一阶段渗透压控制补料发酵策略提高了25.7%和2.2%。为目前报道的以甘油发酵生产赤藓糖醇的最高产量。有效达到了高渗发酵赤藓糖醇高产量、高得率、高生产强度的统一。(4)蛋白组学及中心代谢基因转录水平研究Y.lipolytica高渗响应机制蛋白组学研究发现44种表达水平受渗透压显著影响的差异蛋白,主要分布于pI 3-10,Mw 14.4-97.4 kDa,主要涉及能量代谢、新陈代谢、细胞自救及胁迫响应途径等。在蛋白表达水平揭示高渗促进赤藓糖醇合成原因是与多元醇合成相关蛋白被显著诱导,如TKL、TPI、AKRs等。高渗还可诱导其它胁迫响应途径蛋白,如热激响应蛋白HSPs,氧化胁迫响应蛋白CAT、SOD等。并可通过抑制与蛋白及核酸合成相关酶的表达,如60S核糖体蛋白L2/L4、翻译延长因子、磷酸核糖转移酶,从而抑制菌体生长。此外,RT-PCR研究发现,高渗可抑制EMP途径基因TDH1、PGI1、PFK1、PYK1的转录水平;对糖异生途径基因GUT1,FBP1及TCA循环基因CIT1,KGD1转录水平有诱导作用,以强化高渗下的底物利用效率及能量供给。高渗可诱导HMP途径赤藓糖醇合成关键基因TKL1、ER1的转录水平,并使氧化应激响应蛋白基因SOD1,CAT1转录水平大幅上调,从而促进赤藓糖醇作为相容性溶质大量合成。本研究从蛋白表达及基因转录水平证实高渗促进赤藓糖醇合成的可能原因是EMP向HMP的代谢途径偏转。(5)渗透压保护剂及抗氧化剂提升赤藓糖醇生产强度不同初始渗透压可改变胞内游离氨基酸的组成及含量,渗透压提升会促进胞内游离氨基酸总量的增加。甘氨酸和脯氨酸是良好的渗透压保护剂。Y.lipolytica会将外源添加甘氨酸和脯氨酸转运至胞内并大量积累,以提升耐高渗胁迫能力。高渗可提升氧化应激响应关键酶SOD、CAT的酶活水平。添加抗氧化剂Asc、Cys可适当降低氧化胁迫对酵母细胞的破坏。渗透压保护剂及抗氧化剂添加可提升赤藓糖醇生产强度。利用两阶段渗透压控制补料发酵策略,加入30 mg·L–1甘氨酸、40 mg·L–1脯氨酸、30 mmol·L–1 Asc和3.0 mmol·L–1 Cys,发酵时间减少为174 h,甘油消耗速率为2.41 g·L–1·h–1,生产强度P为1.13 g·L–1·h–1,分别比未添加时增加了-14.7%、23.6%和18.9%,进一步提升了高渗发酵赤藓糖醇的生产强度,但对赤藓糖醇终浓度及得率未见显著影响。