拟穴青蟹细胞周期及泛素系统若干基因参与性腺发育的研究

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拟穴青蟹是我国东南沿海重要的经济养殖蟹类之一。目前对于青蟹性腺发育调控的分子机制研究较为薄弱。细胞周期及泛素系统相关基因参与性腺发育的研究已在其他物种中多有报道。因而克隆青蟹细胞周期及泛素系统相关基因,并研究其参与性腺发育的作用机制具有重要的理论意义和应用前景。本研究在实验室所构建的青蟹EST文库基础上筛选出细胞周期及泛素系统的相关基因片段,利用SMART RACE技术克隆出其全长cDNA序列,并利用荧光定量PCR技术及原位杂交技术检测这些基因在雌蟹各组织及性腺不同发育阶段中的表达情况。结果如下:1) Sp-cdc2的cDNA全长为1593bp,编码含299个氨基酸的蛋白。荧光定量PCR结果显示,Sp-cdc2在卵巢中的表达水平极显著地高于其他各组织的表达水平(P<0.01);在性腺发育过程中Sp-cdc2在卵巢各期的表达水平并无显著性差异(P>0.05),而在精巢T2期的表达水平显著高于T1与T3期的表达水平(P<0.05)。2) Sp-cycB全长cDNA序列为1492bp,编码含391个氨基酸的蛋白,Sp-cycB在卵巢中的表达水平极显著地高于其他各个组织(P<0.01),而在肝胰腺中的表达水平次之;Sp-cycB在O6期中的表达水平显著高于前5期及精巢的表达水平(P<0.05),卵巢前5期的表达水平也显著高于T1期的表达水平(P<0.05),而在精巢各发育阶段的表达水平无显著性差异(P>0.05)。3) Sp-cycH全长cDNA序列为1523bp,编码含332个氨基酸的蛋白,Sp-cycH在卵巢中的表达水平极显著高于其他各组织的表达水平(P<0.01),而在肌肉中的表达水平次之。Sp-cycH在卵巢O6期中的表达水平显著高于其他各阶段的性腺(P<0.05),在O5期和T2期中的表达水平也显著高于T1期的表达水平。4) Sp-CKS1B基因全长cDNA序列为722bp,编码含86个氨基酸的蛋白;Sp-CKS1B在卵巢中的表达水平极显著地高于其他各组织(P<0.01),而在血液、胃和眼睛中的表达水平次之;Sp-CKS1B在T1期中的表达水平最高,并显著高于卵巢前5期和T3期,其次为O6期和T2期。5) Sp-Ub全长cDNA序列为555bp,编码含154个氨基酸的蛋白;Sp-Ub在鳃中的表达水平最高,卵巢次之,各组织间的表达水平无显著性差异,提示Sp-Ub基因在各组织中的表达恒定,具普遍作用;性腺表达结果显示Sp-Ub在O6期的表达水平最高,其次为T2期,且二者的表达水平都与O2、O4、T3期具有显著差异(P<0.05),其他各期之间的差异并不显著。6) Sp-uce2的全长cDNA序列为971bp,编码含160个氨基酸的蛋白;Sp-uce2在卵巢中的表达水平显著高于其他各组织(P<0.05),而在胃和心脏中的表达水平次之;性腺表达结果显示Sp-uce2在T2期的表达水平著高于其他各期的性腺(P<0.05),其次为O5期,O5期的表达水平也显著高于其他各期的性腺(P<0.05)。7) Sp-UCHL3全长cDNA序列为1804bp,编码含228个氨基酸的蛋白。Sp-UCHL3在卵巢中的表达水平极显著高于其他各组织(P<0.01);Sp-UCHL3基因在O6期的表达水平最高,其次为O1,T3期,而在T2期最低,在O1和O6期的表达水平均显著高于O3、O4、O5、T1和T2(P<0.05),T3则显著高于O4、T1与T2期(P<0.05)。8) Sp-UCHL5全长cDNA序列1217bp,编码含337个氨基酸的蛋白,Sp-UCHL5在卵巢中的表达水平极显著地高于其他各组织(P<0.01),而在眼睛中的表达水平次之;Sp-UCHL5在O6期的表达水平最高,其次为O3期,二者中的表达水平均极显著高于O4, T1、T2、T3期的性腺,而在精巢3期的表达水平无显著性差异(P>0.05)。9)原位杂交结果显示Sp-cdc2和Sp-cycB mRNA在精卵巢不同发育阶段中的分布具有相似性。在精子发生过程中Sp-cdc2和Sp-cycB mRNA在精子细胞中大量表达,而在精原细胞中没有发现杂交信号;在卵子发生过程中Sp-cdc2和Sp-cycB mRNA分布于滤泡细胞,而在卵母细胞中没有发现杂交信号。暗示了Sp-cdc2与Sp-cycB转录本在精子发生和卵子发生过程中可能具有相同的表达模式。总之,这些研究成果为阐明细胞周期及泛素系统相关基因在拟穴青蟹精巢和卵巢发育过程中发挥的作用奠定了基础。
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