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神经母细胞瘤(Nuroblastoma，NB)是起源于肾上腺和脊柱旁的交感神经链，由未分化的交感神经细胞所组成，该瘤生长迅速，转移早，恶性程度高，且临床疗效差。是小儿最常见的恶性实体瘤之一，仅次于肾母细胞瘤，好发部位为肾上腺及脊柱旁交感神经链，大部分发生于腹膜后，胸部较少见；多发年龄为6岁以下的婴幼儿，以男性多见；一般首诊时已属晚期。近年来，随着超声及影像学检查发展，临床对症支持治疗如术后监护水平的提高，神经母细胞瘤患儿总的治愈率却提高不大，肿瘤的浸润及转移仍是临床面临的主要难题，且是导致神经母细胞瘤患儿死亡主要原因。目前，运用分子生物学手段探索神经母细胞瘤的浸润与转移机制成为国内外研究的热点。
CD44是位于人类第11号染色体短臂上的基因，其表达产物是细胞膜表面跨膜糖蛋白粘附分子[3]，即透明质酸分子受体。有研究表明许多发生浸润及转移的肿瘤，几乎都有该变异型基因CD44v6的过度表达。CD44v6可在多种信号途径中的酶及离子的作用下，促进肿瘤周围血管生成，使肿瘤细胞产生耐药性[4]，促进肿瘤细胞侵袭及转移。
Steeg1等从鼠黑色素瘤亚细胞克隆中分离出位于染色体17q21.的nm23基因，包含5个外显子和4个内含子，片段长约10kb，是公认的具有抑制肿瘤转移功能的基因，通过G蛋白信号途径发挥转录调控作用，影响细胞的增殖分化与凋亡及抑制肿瘤转移。
目的：
目前，NB的研究方法多集中在体外细胞培养方面，而肿瘤的发生发展是受机体复杂内环境综合作用的结果，体外培养的肿瘤细胞生长环境与机体环境存在差异，本实验收集神经母细胞瘤患儿术中肿瘤组织及正常组织作为标本，采用RT-PCR和免疫组化方法检测标本中CD44v6和nm23mRNA及其蛋白表达状况，分析其与肿瘤的发生及转移的关系，旨在寻找可以预测患儿病情预后的指标，为临床治疗提供理论依据。
实验方法：
1．选择实验对象、采集组织标本、整理患者的临床资料
收集2008年2月-2010年5月在郑州大学第三附属医院及一附院小儿外科手术切除神经母细胞瘤组织及正常组织(距肿瘤5cm)各40例，分别作为研究组和对照组。同时搜集患者的性别，临床分期，病理类型，以及有无淋巴结转移等方面的临床资料，用于统计分析和研究。
2．PCR步骤
1设计引物，在GenBank检索人β-actin、CD44v6和nm23编码基因序列，利用Primer引物设计软件分别对CD44v6和nm23基因的上下游引物进行设计，均设计在2个外显子的连接处，以确保引物核苷酸序列不具有DNA多态性，避免DNA污染。
2依据Trizol试剂说明书，分别提取研究组和正常组织标本的mRNA。
3使用逆转录酶MMLV（莫洛尼氏鼠白血病病毒）逆转录试剂盒对提取的CD44v6和nm23mRNA分别进行cDNA的逆转录。
4分别采用适当温度试验性扩增内参β-actin、CD44v6和nm23cDNA。最适温度下所得扩增产物即为RT-PCR产物。
5制作琼脂糖凝胶，同时加入溴化乙锭，将扩增产物在琼脂糖凝胶内进行电泳。经凝胶成像分析系统摄影，用相应软件扫描仪测定PCR产物表达量。
6免疫组化方法检测CD44v6和nm23两种蛋白的表达情况。阳性细胞的胞膜和胞质着色，按照染色结果的强度分别进行计分。
7统计学分析
应用SPSS16.0统计软件进行分析，独立样本组间比较采用t检验等方法对实验数据进行统计学处理，数据以s±(x)表示,P＜0.05为差异有统计学意义。
实验结果：
1 CD44v6mRNA在肿瘤组织中表达水平高于正常组织，发生淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，差异均有统计学意义。
2 nm23mRNA表达水平在肿瘤组织中低于正常组织，在发生淋巴结转移组低于无淋巴结转移的组。
3 CD44v6蛋白阳性表达率在肿瘤组织中高于瘤旁正常组织，在淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，Ⅲ-Ⅳ期组明显高于Ⅰ-Ⅱ期组。
4 nm23蛋白阳性表达率在肿瘤组织中低于瘤旁正常组织，在发生淋巴结转移组低于无淋巴结转移组，Ⅲ-Ⅳ期组值低于Ⅰ-Ⅱ期组。
结论：
CD44v6表达水平高促进神经母细胞瘤发生、侵润及转移；nm23表达水平高可能抑制神经母细胞瘤发生、侵润及转移。