背景蜱是寄生在动物体表的专性吸血的节肢动物,是多种新发传染病的重要传播媒介。蜱和蜱传疾病（Tick-borne diseases,TBDs）在全球范围内具有重要的医学意义,蜱通过吸血传播病原体,对动物和人类的健康造成了重大危害。蜱传疾病在世界各地都有报告,而且人类感染新发蜱传疾病的种类和报告病例数量不断上升。比如发热伴血小板减少综合征（Severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS）,是近年来在我国发现的一种新发传染病,长角血蜱被认为是其传播媒介。我国地理位置十分复杂,地貌变化多样使得蜱传疾病的种类和分布也呈多样性。随着越来越多影响人类健康的病原体被发现,蜱传疾病的监测在我国已经变得越来越重要。SFTS是2010年在我国首次发现的,其病原体是发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）,属于布尼亚病毒科。除我国之外,该病毒在韩国和日本也有广泛分布。SFTSV是分节段的RNA病毒,分为L、M、S三个片段。SFTS患者的临床症状没有特异性,主要包括发热、血小板减少、胃肠道症状和白细胞减少等,有时也会出现严重的临床症状,可发展为多器官功能障碍综合征（MODS）,病死率20%以上。目前,该病毒的致病机制尚不清楚。病毒的M片段编码两个囊膜蛋白Gn和Gc,它们在病毒入侵细胞和成熟病毒颗粒释放到细胞外的过程中发挥关键作用。根据其它布尼亚病毒的研究,囊膜蛋白Gn和Gc是病毒表面的两种主要抗原成分,是特异性中和抗体的靶目标。目前的报道仅筛选到两株抗SFTSV的Gn蛋白抗原位点的具有中和活性的人源单克隆抗体,而Gc蛋白是否存在中和表位尚不清楚。迄今为止,还没有任何特异性的针对SFTS的疫苗及治疗药物。我们实验室以前的研究发现,感染SFTSV的病人体内会产生中和抗体,可以维持较长的时间,提供保护性。因此,中和抗体可以用于易感人群和重症病人的紧急预防与治疗,筛选有中和活性的人源单克隆抗体可以用来治疗和预防SFTSV感染。目的检测山东省胶南市采集的蜱携带的部分病原体的种类,并进行基因序列分析,进一步了解中国蜱传疾病的流行情况,为预防和控制新发人兽共患传染病提供依据;通过对SFTSV囊膜蛋白的活性研究明确囊膜蛋白Gc是否存在中和表位,对后续的抗体开发提供指导意义;将新筛选的3株人源单克隆抗体进行生物学活性研究,对疫苗的开发和SFTS的治疗提供理论基础。方法1.蜱标本采集用大小为1m~2的白布在草地上拖过收集蜱,根据蜱的外形结构和线粒体16SrRNA基因分子生物学检测鉴定蜱的种属。2.蜱携带病原体检测提取蜱总DNA和RNA,PCR检测立克次体、弗朗西斯菌、莱姆病和Q热的病原体,RT-PCR检测克里米亚-刚果出血热病毒。阳性PCR产物克隆到pMD19-T载体上,双向测序后,将测序结果在NCBI中的BLAST进行比对发现其种属归类,计算蜱感染各病原体的最小感染率。3.基因序列分析通过DNAstar软件进行基因序列同源性的分析比较,用MEGA7.0软件的最大似然法（Maximum Likelihood,ML）制作系统发育进化树,设定Bootstrap值为1,000。4.SFTSV囊膜蛋白表达、纯化将SFTSV的Gn和Gc基因克隆至pCAGGS真核表达载体,在HEK 293T真核细胞中表达,用Western blot的方法鉴定蛋白的表达;亲和层析和凝胶层析纯化囊膜蛋白Gn和Gc,经SDS-PAGE实验进行鉴定。5.小鼠免疫及抗血清中和活性检测将纯化的蛋白与佐剂混合后分别免疫昆明小鼠。将Gn和Gc蛋白分别包被于ELISA板,通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠血清中抗体的效价,通过间接免疫荧光实验和微量中和实验检测血清中抗体的病毒结合活性和中和活性。6.人源单克隆抗体表达及纯化通过噬菌体展示技术,新筛选到3株抗Gn蛋白的单链抗体（single-chain fragment variable,scFv）。将scFv的序列通过网站https://www.imgt.org/IMGT＿vquest/input分析,确定轻、重链可变区的类型、长度及相应轻链的类型,通过重叠PCR搭建完整的人源单克隆抗体的全长结构。分别将轻、重链克隆到pCAGGS真核表达载体中,在HEK 293T细胞中进行表达。用Western blot的方法鉴定单抗的表达,通过亲和层析和凝胶层析将单抗进一步纯化,并经SDS-PAGE实验进行鉴定。7.人源单克隆抗体生物学活性研究ELISA检测表达的人源单克隆抗体与Gn蛋白的结合活性;间接免疫荧光实验检测人源单克隆抗体与病毒的结合活性;微量中和实验检测人源单克隆抗体的中和活性。结果1.根据形态学和线粒体16S rRNA基因（rrs）鉴定,采集的2,560只蜱均为长角血蜱。2.将2,560只蜱分组用PCR检测（rrs、gltA、ompB和ompA基因）,17组蜱立克次体阳性,立克次体的最小感染率为0.66%（17/2560）。综合序列同源性分析与进化树分析表明,17个立克次体阳性样本分为三种不同的基因型。样本J244与长角血蜱立克次体（Candidatus Rickettsia longicornii）同源性最高,在同一分支,属于长角血蜱立克次体（Candidatus Rickettsia longicornii）;J84、J85和J217三个样本与加拿大立克次体（Rickettsia canadensis）同源性最高,但系统进化的分支距离较远,不完全相同,属于一种新的立克次体,命名为胶南立克次体（Candidatus Rickettsia jiaonani）;其余13个样本与R.japonica同源性最高且在同一分支,属于日本立克次体（R.japonica）。3.PCR扩增弗朗西斯菌的rrs基因与tpiA基因,2组标本阳性,弗朗西斯菌最小感染率为0.08%（2/2,560）。两个阳性样本与韩国的褐黄血蜱体内的弗朗西斯共生菌（Francisella-like endosymbiont,FLE）的rrs基因同源性分别为99.8%和99.4%,与tpiA基因同源性分别为100%和99.3%,在系统发育上两个阳性样本均与褐黄血蜱的FLE在同一分支上,与其他Francisella属分支较远,表明本次检测到的两株弗朗西斯菌均属于FLEs组。4.PCR检测莱姆病及Q热病原体,RT-PCR检测克里米亚-刚果出血热病毒,所有蜱均为阴性。5.成功构建SFTSV囊膜蛋白Gn和Gc的载体并表达纯化。微量中和实验中,Gn和Gc蛋白免疫组小鼠收获的抗血清在稀释度为1:4～1:64时可以有效中和病毒,证明Gn和Gc蛋白均存在中和表位。6.成功构建了3株人源单克隆抗体（4-6,1B2,1F6）,并且在真核细胞中表达及纯化。微量中和实验表明,浓度为50μg/ml时,3株人源单克隆抗体均可以有效中和SFTS病毒。结论1.对采集的2,560只长角血蜱进行了部分传染病病原体的分子生物学调查研究。发现这些蜱携带多种立克次体与弗朗西斯菌FLE。我们发现山东胶南存在日本立克次体和一种新的立克次体,为传染病防控提供了理论依据。2.表达并纯化了SFTSV的Gn和Gc蛋白,用其免疫小鼠获得了相应的抗血清。微量中和实验表明这两种蛋白免疫小鼠所产生的抗血清均具有中和SFTSV的活性。证明囊膜蛋白Gc存在中和表位,对后续的治疗性抗体开发具有指导意义。3.成功将新筛选到的3株抗Gn蛋白的单链抗体（scFv）通过搭配轻、重链相应的恒定区构建了完整的抗体结构,并在真核系统中表达及纯化。证明了3株单抗在细胞水平都具有中和病毒的活性,这为进一步的疫苗研究提供了基础。