论文部分内容阅读
目的：
慢性乙型病毒性肝炎(慢乙肝)的临床治疗仍面临巨大的挑战，目前用于慢乙肝的临床治疗药物仅有干扰素(Interferon, IFN)和核苷酸类似物(Nucleoside analogue，NAs)两大类，按照现有的治疗方案——不论是这两类药物的单用，序贯或不同组合方式的联合应用，其治愈率(乙肝病毒表面抗原(HepatitisBsurfaceantigen，HBsAg)转阴或消失)均不超过20%，说明80%以上接受治疗的患者目前仍不能达到临床治愈，且HBsAg转阴的部分病人仍然有重新转变为阳性，并且乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)再激活的风险。因此，慢乙肝依据现在的治疗方案要进一步提高临床治愈率将很困难。导致临床慢乙肝难治困境的根本原因，是由于病毒复制的模板——共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，cccDNA)在肝细胞内的持续存在，使得HBV持续感染和抗病毒药物停用后病情反复。只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，达到慢乙肝的彻底治愈，然而，目前尚无有效抑制或清除肝内cccDNA的临床药物或治疗方案。因此，针对慢乙肝的治疗，还必须要开辟新的思路和途径，尤其是如何有效的清除HBV复制的原始模板cccDNA，是目前抗病毒治疗亟待解决的难题，因此本研究的目的在于寻找、研究针对清除HBVDNA，尤其是复制模板cccDNA的治疗靶点，为提高慢性乙型病毒性肝炎的临床治愈率，以及未来慢乙肝的彻底治愈提供新的策略和思路。
方法：
1基于GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中的芯片数据，结合生物信息学分析方法，寻找慢乙肝病人肝组织与正常肝组织之间的差异基因，并进行信号通路富集分析，筛选出差异基因中的关键基因。
2利用蛋白免疫印迹技术(Western blotting，WB)检测：(1)在HBV持续复制或复制受到抑制后，HepAD38细胞系的AKT磷酸化蛋白的表达情况；(2)在HepG2.2.15细胞系上，敲低p70核糖体蛋白S6激酶(70 kDa ribosomal protein S6 kinase，P70S6K)后，P70S6K以及氨甲酰合成酶Ⅱ-天冬氨酸转氨甲酰酶-二氢乳清酸酶(Carbamoyl phosphate synthetase-aspartate carbamoyltransferase-dihydroorotase ， CAD)蛋白的表达情况；(3)HepG2.2.15细胞中，CAD沉默及过表达后，CAD和P70S6K的表达情况。
3利用微滴式数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)检测：(1)HBV长期复制细胞系(HepG2.2.15、HepAD38)在经过关键靶蛋白抑制剂处理后，细胞培养上清中HBVDNA、细胞内HBVDNA以及细胞内HBVcccDNA的拷贝数；(2)P70S6K、CAD敲低和过表达后，HepG2.2.15细胞内HBVDNA以及HBVcccDNA的拷贝数；(3)HBV长期存在小鼠模型(C57小鼠、肝脏特异性PTEN条件性敲除小鼠)血清中HBVDNA的拷贝数。
4利用Real-timePCR的方法，检测AKT下游关键信号节点抑制剂处理HepG2.2.15细胞后，细胞内HBVpgRNA的相对定量。
5利用尾静脉高压注射PAAV-HBV1.2质粒的方法，建立HBV长期存在的小鼠模型。
6利用免疫组化的方法，检测HBV长期存在小鼠模型肝组织中HBsAg及AKT-S473的表达情况。
7应用流式细胞术检测经过AKT、mTORC1、P70S6K抑制剂处理后，HepG2.2.15细胞的凋亡情况。
8应用Seahorse细胞外流量分析技术，检测AKT、mTORC1、P70S6K抑制剂处理后HepG2.2.15细胞糖酵解能力的变化。
结果：
1生物信息学分析结果显示：AKT1是慢乙肝病人肝组织与正常人肝组织的关键差异基因，与正常组相比，HBV感染患者肝组织中的AKT1表达明显增高。
2在HepAD38细胞系中，去掉多西环素(Doxycycline)使得HBV复制开始启动。随着HBV复制增加，AKT的磷酸化水平明显增高。此外，利用AKT抑制剂对HepAD38进行处理后，细胞内HBVDNA及cccDNA的复制水平明显降低。
3通过对HBV慢性感染的肝脏特异性PTEN条件性敲除小鼠模型血清中的HBVDNA的连续监测，发现小鼠(纯合小鼠)血清中的HBVDNA拷贝数较对照组(野生型小鼠和杂合小鼠)显著增多。
4利用AKT抑制剂AZD5363对慢性HBV感染的C57小鼠模型进行灌胃后，小鼠血清中的HBVDNA较对照组(PBS灌胃组)显著降低，且HBVDNA的清除速度较对照组加快。
5对AKT、mTORC1、P70S6K抑制剂处理的HepG2.2.15细胞进行细胞外流量分析，发现细胞糖酵解能力明显降低。
6筛选AKT下游关键信号节点蛋白对HBVDNA及cccDNA复制合成的影响，发现P70S6K抑制剂LY2584702能够降低HepG2.2.15细胞培养上清中的HBVDNA复制水平，并且对细胞内的HBVDNA及cccDNA也起到抑制作用；在HepG2.2.15细胞内敲低P70S6K后，发现细胞内HBVDNA及cccDNA复制合成水平降低。
7检测AKT、mTORC1、P70S6K抑制剂处理的HepG2.2.15细胞凋亡水平，结果显示上述蛋白抑制剂在抑制HBVDNA及cccDNA复制的有效浓度下，并未对HepG2.2.15细胞的凋亡产生影响。
8在HepG2.2.15细胞内敲低CAD后，细胞培养上清中的HBVDNA及细胞内cccDNA的拷贝数明显降低；在HepG2.2.15细胞中过表达CAD，细胞内HBVDNA及cccDNA的拷贝数增高；在敲低了CAD的HepG2.2.15细胞中对CAD进行过表达后，能恢复细胞内HBVDNA复制水平。
9在敲低了P70S6K的HepG2.2.15细胞内过表达CAD后，细胞内的HBVDNA拷贝数显著增加，但细胞内的cccDNA变化并不明显。
10利用二轻乳清酸脱氢酶(Dihydroorate dehydrogenase，DHODH)抑制剂特立氟胺(Teriflunomide，Teri)，对HepG2.2.15细胞进行加药处理，发现细胞培养上清中的HBVDNA，以及细胞内HBVDNA和cccDNA显著降低，并具有剂量依赖性和时间依赖性。但在CAD敲低的HepG2.2.15细胞加入Teri后，发现与CAD敲低细胞相比，细胞培养上清中的HBVDNA，以及细胞内HBVDNA和cccDNA未有明显变化。
结论：
通过生物信息学数据分析，发现在慢乙肝病人肝组织内AKT1的表达水平明显增高。体外实验中，利用HepAD38细胞系进一步验证生物信息学结果，发现AKT的磷酸化水平会随着HBV复制的增加而升高，利用AKT抑制剂处理HepAD38细胞后，细胞培养上清中的HBVDNA及细胞内的HBVcccDNA的拷贝数明显降低。在动物体内实验(C57小鼠、肝脏特异性PTEN条件性敲除小鼠上建立的HBV慢性感染小鼠模型)也得到了与体外实验相一致的结果，说明HBV的复制能够活化AKT，且AKT的活化对病毒的复制合成起到促进作用。通过利用AKT下游蛋白GSK3β、4EBP1、P70S6K的抑制剂处理HepG2.2.15细胞，发现P70S6K的抑制剂对HepG2.2.15细胞培养上清中HBVDNA，以及细胞内HBVDNA和cccDNA的复制合成起到抑制作用。此外，通过在HepG2.2.15细胞上敲低P70S6K，进一步证实AKT下游蛋白P70S6K与HBVDNA及cccDNA的复制合成存在关联。通过对其机制的初步探究，发现P70S6K是通过影响CAD的磷酸化，从而影响到HBVDNA及cccDNA的复制合成，初步研究发现，这可能与影响嘧啶核苷酸的合成有关。
本论文主要研究了AKT对HBVDNA尤其是HBV复制的原始模板cccDNA的影响，初步探究了AKT对HBV模板DNA影响的机制，探讨了HBVDNA及cccDNA复制合成过程中嘧啶核苷酸合成途径对病毒合成的重要作用。本研究实验结果显示靶向P70S6K及嘧啶核苷酸合成途径的关键酶CAD，通过影响DNA合成的必须原材料，来影响HBVDNA以及cccDNA复制合成，可为临床上针对HBVcccDNA的靶向抗病毒治疗提供新的策略。
慢性乙型病毒性肝炎(慢乙肝)的临床治疗仍面临巨大的挑战，目前用于慢乙肝的临床治疗药物仅有干扰素(Interferon, IFN)和核苷酸类似物(Nucleoside analogue，NAs)两大类，按照现有的治疗方案——不论是这两类药物的单用，序贯或不同组合方式的联合应用，其治愈率(乙肝病毒表面抗原(HepatitisBsurfaceantigen，HBsAg)转阴或消失)均不超过20%，说明80%以上接受治疗的患者目前仍不能达到临床治愈，且HBsAg转阴的部分病人仍然有重新转变为阳性，并且乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)再激活的风险。因此，慢乙肝依据现在的治疗方案要进一步提高临床治愈率将很困难。导致临床慢乙肝难治困境的根本原因，是由于病毒复制的模板——共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，cccDNA)在肝细胞内的持续存在，使得HBV持续感染和抗病毒药物停用后病情反复。只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，达到慢乙肝的彻底治愈，然而，目前尚无有效抑制或清除肝内cccDNA的临床药物或治疗方案。因此，针对慢乙肝的治疗，还必须要开辟新的思路和途径，尤其是如何有效的清除HBV复制的原始模板cccDNA，是目前抗病毒治疗亟待解决的难题，因此本研究的目的在于寻找、研究针对清除HBVDNA，尤其是复制模板cccDNA的治疗靶点，为提高慢性乙型病毒性肝炎的临床治愈率，以及未来慢乙肝的彻底治愈提供新的策略和思路。
方法：
1基于GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中的芯片数据，结合生物信息学分析方法，寻找慢乙肝病人肝组织与正常肝组织之间的差异基因，并进行信号通路富集分析，筛选出差异基因中的关键基因。
2利用蛋白免疫印迹技术(Western blotting，WB)检测：(1)在HBV持续复制或复制受到抑制后，HepAD38细胞系的AKT磷酸化蛋白的表达情况；(2)在HepG2.2.15细胞系上，敲低p70核糖体蛋白S6激酶(70 kDa ribosomal protein S6 kinase，P70S6K)后，P70S6K以及氨甲酰合成酶Ⅱ-天冬氨酸转氨甲酰酶-二氢乳清酸酶(Carbamoyl phosphate synthetase-aspartate carbamoyltransferase-dihydroorotase ， CAD)蛋白的表达情况；(3)HepG2.2.15细胞中，CAD沉默及过表达后，CAD和P70S6K的表达情况。
3利用微滴式数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)检测：(1)HBV长期复制细胞系(HepG2.2.15、HepAD38)在经过关键靶蛋白抑制剂处理后，细胞培养上清中HBVDNA、细胞内HBVDNA以及细胞内HBVcccDNA的拷贝数；(2)P70S6K、CAD敲低和过表达后，HepG2.2.15细胞内HBVDNA以及HBVcccDNA的拷贝数；(3)HBV长期存在小鼠模型(C57小鼠、肝脏特异性PTEN条件性敲除小鼠)血清中HBVDNA的拷贝数。
4利用Real-timePCR的方法，检测AKT下游关键信号节点抑制剂处理HepG2.2.15细胞后，细胞内HBVpgRNA的相对定量。
5利用尾静脉高压注射PAAV-HBV1.2质粒的方法，建立HBV长期存在的小鼠模型。
6利用免疫组化的方法，检测HBV长期存在小鼠模型肝组织中HBsAg及AKT-S473的表达情况。
7应用流式细胞术检测经过AKT、mTORC1、P70S6K抑制剂处理后，HepG2.2.15细胞的凋亡情况。
8应用Seahorse细胞外流量分析技术，检测AKT、mTORC1、P70S6K抑制剂处理后HepG2.2.15细胞糖酵解能力的变化。
结果：
1生物信息学分析结果显示：AKT1是慢乙肝病人肝组织与正常人肝组织的关键差异基因，与正常组相比，HBV感染患者肝组织中的AKT1表达明显增高。
2在HepAD38细胞系中，去掉多西环素(Doxycycline)使得HBV复制开始启动。随着HBV复制增加，AKT的磷酸化水平明显增高。此外，利用AKT抑制剂对HepAD38进行处理后，细胞内HBVDNA及cccDNA的复制水平明显降低。
3通过对HBV慢性感染的肝脏特异性PTEN条件性敲除小鼠模型血清中的HBVDNA的连续监测，发现小鼠(纯合小鼠)血清中的HBVDNA拷贝数较对照组(野生型小鼠和杂合小鼠)显著增多。
4利用AKT抑制剂AZD5363对慢性HBV感染的C57小鼠模型进行灌胃后，小鼠血清中的HBVDNA较对照组(PBS灌胃组)显著降低，且HBVDNA的清除速度较对照组加快。
5对AKT、mTORC1、P70S6K抑制剂处理的HepG2.2.15细胞进行细胞外流量分析，发现细胞糖酵解能力明显降低。
6筛选AKT下游关键信号节点蛋白对HBVDNA及cccDNA复制合成的影响，发现P70S6K抑制剂LY2584702能够降低HepG2.2.15细胞培养上清中的HBVDNA复制水平，并且对细胞内的HBVDNA及cccDNA也起到抑制作用；在HepG2.2.15细胞内敲低P70S6K后，发现细胞内HBVDNA及cccDNA复制合成水平降低。
7检测AKT、mTORC1、P70S6K抑制剂处理的HepG2.2.15细胞凋亡水平，结果显示上述蛋白抑制剂在抑制HBVDNA及cccDNA复制的有效浓度下，并未对HepG2.2.15细胞的凋亡产生影响。
8在HepG2.2.15细胞内敲低CAD后，细胞培养上清中的HBVDNA及细胞内cccDNA的拷贝数明显降低；在HepG2.2.15细胞中过表达CAD，细胞内HBVDNA及cccDNA的拷贝数增高；在敲低了CAD的HepG2.2.15细胞中对CAD进行过表达后，能恢复细胞内HBVDNA复制水平。
9在敲低了P70S6K的HepG2.2.15细胞内过表达CAD后，细胞内的HBVDNA拷贝数显著增加，但细胞内的cccDNA变化并不明显。
10利用二轻乳清酸脱氢酶(Dihydroorate dehydrogenase，DHODH)抑制剂特立氟胺(Teriflunomide，Teri)，对HepG2.2.15细胞进行加药处理，发现细胞培养上清中的HBVDNA，以及细胞内HBVDNA和cccDNA显著降低，并具有剂量依赖性和时间依赖性。但在CAD敲低的HepG2.2.15细胞加入Teri后，发现与CAD敲低细胞相比，细胞培养上清中的HBVDNA，以及细胞内HBVDNA和cccDNA未有明显变化。
结论：
通过生物信息学数据分析，发现在慢乙肝病人肝组织内AKT1的表达水平明显增高。体外实验中，利用HepAD38细胞系进一步验证生物信息学结果，发现AKT的磷酸化水平会随着HBV复制的增加而升高，利用AKT抑制剂处理HepAD38细胞后，细胞培养上清中的HBVDNA及细胞内的HBVcccDNA的拷贝数明显降低。在动物体内实验(C57小鼠、肝脏特异性PTEN条件性敲除小鼠上建立的HBV慢性感染小鼠模型)也得到了与体外实验相一致的结果，说明HBV的复制能够活化AKT，且AKT的活化对病毒的复制合成起到促进作用。通过利用AKT下游蛋白GSK3β、4EBP1、P70S6K的抑制剂处理HepG2.2.15细胞，发现P70S6K的抑制剂对HepG2.2.15细胞培养上清中HBVDNA，以及细胞内HBVDNA和cccDNA的复制合成起到抑制作用。此外，通过在HepG2.2.15细胞上敲低P70S6K，进一步证实AKT下游蛋白P70S6K与HBVDNA及cccDNA的复制合成存在关联。通过对其机制的初步探究，发现P70S6K是通过影响CAD的磷酸化，从而影响到HBVDNA及cccDNA的复制合成，初步研究发现，这可能与影响嘧啶核苷酸的合成有关。
本论文主要研究了AKT对HBVDNA尤其是HBV复制的原始模板cccDNA的影响，初步探究了AKT对HBV模板DNA影响的机制，探讨了HBVDNA及cccDNA复制合成过程中嘧啶核苷酸合成途径对病毒合成的重要作用。本研究实验结果显示靶向P70S6K及嘧啶核苷酸合成途径的关键酶CAD，通过影响DNA合成的必须原材料，来影响HBVDNA以及cccDNA复制合成，可为临床上针对HBVcccDNA的靶向抗病毒治疗提供新的策略。