随着食品加工业的发展,食物过敏已经成为一个严重的公众健康问题,反应程度可以从轻微的局部症状到严重的全身性反应。以虾为代表的水产甲壳类是FAO确定的八大类致敏食物之一,虾类的过敏原有原肌球蛋白(TM)、精氨酸激酶(AK)、肌钙结合蛋白(SCP)和肌球蛋白轻链(MLC)等,其中TM是虾类的主要过敏原。引起过敏反应的主要是食物中的一些蛋白质,人体摄入过敏原经过消化后仍能引发过敏反应,因而研究人体消化系统对过敏原免疫活性及抗原表位的影响是研究过敏原在人体消化过程中的致敏性变化和解析食物过敏反应机制的关键所在。本文通过富集纯化南美白对虾中主要过敏原TM,体外模拟胃液消化TM,采用SDS-PAGE、Western-blot和间接ELISA分析TM在消化过程中免疫活性的变化。采用质谱方法分析TM的消化产物,结合已知的TM抗原表位,分析了胃液消化过程中TM抗原表位的结构变化。为了确认TM抗原表位和致敏性之间的相关性,选用Balb/c小鼠建立致敏动物模型,通过分析免疫小鼠血清中特异性IgG抗体、IgE抗体及血浆中组胺的变化情况,探讨了TM抗原表位的构效关系。主要研究内容及结果如下:(1)富集南美白对虾中的TM,参照美国药典制备体外模拟胃液消化TM,并对消化产物进行SDS-PAGE、Western-blot和间接ELISA分析。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,随着消化时间的增加,TM条带逐渐变浅,但是在2 h时仍具有免疫活性。间接ELISA结果显示,消化2 h后,TM的免疫活性和过敏原性分布下降89.1%和80.8%。上述结果表明TM在体外模拟人体胃液中被酶解丢失了大部分免疫活性和过敏原性。(2)对TM的体外模拟胃液消化后的产物进行SDS-PAGE和Western-blot,根据分析结果选取不同降解程度的蛋白条带,采用LTQ Orbitrap Velos Pro质谱仪分析TM抗原表位的结构变化。质谱结果表明,TM在胃液消化过程中大部分抗原表位会被破坏,但是TM在胃液中消化2 h时仍具有免疫活性,很可能是因为消化片段中存在有3个不被破坏的抗原表位(肽段111-125、137-141和153-161)和4个抗消化能力很强的抗原表位(肽段50-66、144-151、145-164和150-163)所致,这些抗消化的抗原表位可能是导致虾过敏的关键因素。(3)为了确认TM抗原表位和致敏性之间的相关性,人工合成6个抗消化的抗原表位和2个不抗消化的抗原表位,以TM为阳性对照组、生理盐水为阴性对照组,采用灌胃方式构建Balb/c小鼠致敏动物模型。通过间接ELISA法分析免疫小鼠血清中特异性IgG抗体和IgE抗体变化情况,并用小鼠组胺(HIS)ELISA试剂盒分析小鼠体内的组胺含量。研究结果表明,抗原表位111-125(TKLAEASQAADESER)、抗原表位137-141(DEERM)和抗原表位50-66(MQQLENDLDQVQESLLK)引起小鼠体内的特异性IgE抗体和组胺含量升高,说明致敏性强,进一步验证了TM抗原表位在胃液消化过程中的结构变化。综上所述,南美白对虾中的主要过敏原TM在体外模拟胃液消化过程中会产生一些小分子降解产物,部分抗原表位会被破坏,但是TM在胃液中消化2 h时仍具有免疫活性,很可能是因为消化片段中存在有3个不被破坏的抗原表位和4个抗消化能力很强的抗原表位所致。经致敏动物模型验证,抗原表位111-125(TKLAEASQAADESER)、抗原表位137-141(DEERM)和抗原表位50-66(MQQLENDLDQVQESLLK)很可能是导致虾过敏的关键抗原表位。