根据致病性和致病机制的不同,致病性大肠杆菌可以分为肠道外致病性大肠杆菌（Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC）和肠道内致病性大肠杆菌（Intestinal Pathogenic Escherichia coli,IPEC）。肠道外致病性大肠杆菌主要包括禽致病性大肠杆菌（Avian Pathogenic E.coli,APEC）,尿道致病性大肠杆菌（Uropathogenic E.coli,UPEC）和致新生儿脑膜炎大肠杆菌（Neonatal Meningitis E.coli,NMEC）。禽致病性大肠杆菌是家禽业最重要传染病病原之一,也是潜在的食源性致病菌,主要引起禽类呼吸道感染、全心炎和败血症。人源ExPEC可以引起尿路感染或导致新生儿败血症、脑膜炎。肠道内致病性大肠杆菌根据其致病特征主要分为六类:产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli,ETEC）,肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E.coli,EPEC）,肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E.coli,EHEC）,肠聚集性大肠杆菌（Enteroaggregative coli,EAEC）,肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive E.coli,EIEC）和弥散黏附型大肠杆菌（Diffuse adhesive E.coli,DAEC）。它们共同的特点是通过分泌不同的毒素作用于人或动物的肠上皮细胞引起严重的腹泻,在临床上危害最严重的是ETEC、EHEC和EPEC,每年对畜牧业和养殖业造成严重的经济损失。ExPEC和IPEC严重威胁人和动物的健康,加强对ExPEC和IPEC防控的研究,对养殖业和公共卫生均具有重要的意义。在ExPEC和IPEC的防控中存在的共同问题是依赖于抗生素的防控造成了耐药菌株的不断涌现以及抗生素残留问题,因此迫切需要研制新的替代方法。但是,ExPEC和IPEC的致病机理及调控机制不清楚。虽然目前已鉴定出ExPEC和IPEC大量毒力相关的因子,但是仍然有潜在的致病因子需要发掘,而且这些毒力因子在致病过程中发挥的作用及其调控机制仍然不是很清楚。ArcA和FNR作为全局调控因子,在调节大肠杆菌从有氧到厌氧环境的适应性方面发挥重要的作用。ArcA通过调节细菌对抗活性氧的酶促防御系统而发挥作用,FNR作为氧感应调节子,控制大量酶对细胞外氧气状态的反应,但是ArcA和FNR是否在ExPEC和IPEC的致病过程中发挥重要的作用有待进一步研究。本研究首先通过对ExPEC在LB和鸭血清微氧条件下的转录组进行测序,筛选差异表达基因,对其致病性及ArcA和FNR对这些基因的调控机制进行了研究。同时我们对采自临床上具有腹泻或急性死亡症状仔猪的95株大肠杆菌进行了耐药表型的检测,并进行了全基因组测序,分析了耐药基因型及毒力基因,初步探索了 ArcA和FNR对ETEC毒力基因表达调控的分子机制。1转录组测序分析揭示ExPEC适应宿主体内环境的分子机制ExPEC既能威胁人和动物的健康,又对畜牧业和家禽业造成严重的经济损失,因此对其致病机理的研究十分必要而且迫切。我们首先通过转录组测序比较了 ExPEC分别在血清和LB低氧条件下差异表达的基因。在错误发现率小于10%,两比较之间的q值不大于0.10的限制条件下,发现总共有427个基因在血清中被显著地上调,390个基因显著下调。通过分析发现这些基因可以归为四类:运动性和趋化性相关基因flgBCDEFGHILM、fliACDGHKLMNOPS、motAB、cheAW等;氮和各种氨基酸代谢相关基因;碳中心代谢途径和呼吸链相关基因citCDEFXG、citAB、ybdS、frdABCD等;以及大肠杆菌胞外多糖（ECP）生物合成相关的基因包括脂多糖（LPS）、肠杆菌科细菌共同抗原（ECA）、荚膜、肽聚糖、荚膜异多糖酸、Yjb胞外多糖（yjbEFGH）和D-核糖转运基因（rbsDCBA）等。这项研究揭示了 ExPEC适应宿主系统感染的分子机制。2 ArcA调控ExPEC运动性、趋化性及代谢转录组测序分析明,当ExPEC培养在血清中和微氧条件下时,一系列运动性、趋化性和代谢性基因的表达均发生显著上调,但是这些相关基因的表达调控分子机制仍不清楚。我们对这些基因的启动子区域能结合的调控因子进行了预测,发现氧感应调节因子ArcA可能对其发挥调节作用。荧光定量PCR结果表明在cheA、cheW、cheA&W、motA、motB、motA&B、citC等基因在血清低氧条件下,在AarcA缺失株中的表达量与野生株相比均极显著地降低,ArcA提示直接或间接地调控这些基因的表达。反转录PCR进一步证实motA、motB、cheA和cheW共用一个启动子,而且EMSA结果表明ArcA蛋白可以直接和这个启动子区域相结合从而发挥调节作用,证实ArcA能直接调控这些基因的表达。动物试验结果也表明,arcA、motAB和cheA缺失株的毒力显著下降,而citCDEFXG基因簇的缺失对毒力的影响不显著。但是,在模拟体内环境的鸭血清微氧培养过程中,ΔcitCDEFXG与野生株相比在迟缓期和对数期的生长速度明显降低。这表明,柠檬酸盐代谢对ExPEC的微氧生长有一定的促进作用,而且对大肠杆菌的血清存活起重要作用。进一步对柠檬酸代谢相关的基因的研究发现,ArcA可以直接调控柠檬酸发酵基因的表达,同时也可以通过CitA/CitB二元调控系统间接调控柠檬酸发酵基因的表达,进而调控细菌在应对低氧血清条件下的能量利用。本研究证明ArcA可以通过对ExPEC运动性及趋化性和代谢性基因的直接调控影响细菌的毒力。3 FNR调控ExPEC代谢及抗血清能力转录组研究发现在应对宿主血清和低氧条件下,参与大肠杆菌柠檬酸代谢和胞外多糖生物合成相关的基因的表达量显著升高。受前面ArcA调控机制的启发,我们对这些基因的启动子区域是否能够结合另一个氧感应调节因子FNR进行了预测,发现FNR可能对其发挥调节作用。基因敲除后的功能试验发现,fnr基因的缺失极显著地降低了 ExPEC对柠檬酸的利用,进一步的研究结果证实FNR可以直接调控柠檬酸发酵基因的表达,同时可以通过CitA/CitB二元调控系统间接调控柠檬酸发酵基因的表达。另一方面,qRT-PCR结果表明,11个代表荚膜异多糖酸、荚膜、肠杆菌科细菌共同抗原、Yjb胞外多糖、肽聚糖和LPS等6个ECP合成途径相关基因的转录表达水平在血清中与LB相比均显著上调。但是,fnr基因的缺失显著降低了 11种ECP生物合成基因的表达,而且互补株中各基因的表达又能恢复到野生型的水平。这些结果表明,FNR直接或间接地正调控ECP生物合成基因的表达。EMSA试验分析进一步表明,FNR蛋白可以直接与荚膜合成基因和荚膜异多糖酸生物合成基因带有FNR结合位点的启动子区域结合,但是不能和去除FNR结合位点的启动子区域结合,表明氧气感应因子FNR可以直接促进荚膜和荚膜异多糖酸基因的表达。同时,FNR还可以通过Rcs信号系统调节荚膜异多糖酸,Yjb胞外多糖和肽聚糖的生物合成基因的表达。动物毒力测定试验的结果也表明ECP的生物合成能显著增强ExPEC的致病性。这些研究结果表明全局调控因子FNR,CitA/CitB和Rcs二元调控信号转导系统协调调节ExPEC在宿主血清中代谢和ECP生物合成基因的表达,增加ExPEC的血清抵抗力,从而增强ExPEC的致病性。4 ArcA和FNR对ETEC毒力基因表达调控的分子机制产肠毒素大肠杆菌可引起人或动物严重的腹泻,发热以及急性死亡。因此对于ETEC的耐药性,流行性以及致病分子机制的研究可以有效防控ETEC,降低由于ETEC感染带来的危害。本研究首先对采自美国13个州具有严重腹泻症状仔猪的95株大肠杆菌进行了耐药表型的检测,然后我们通过全基因组测序对这些菌株的耐药基因和毒力基因进行了分析,筛选出一株具有代表性的ETEC菌株用于表达研究。既然ArcA和FNR在对肠道外致病性大肠杆菌的毒力调控中发挥重要作用,那么它们是否也调控IPEC的毒力基因呢?因此我们对ETEC进行了研究。由于ETEC入侵肠上皮细胞的第一步是对细胞进行黏附,因此,我们首先检测了 ArcA和FNR是否影响细菌的黏附,试验结果发现arcA和fnr的缺失显著降低了细菌对细胞的黏附能力,暗示它们对黏附基因可能存在调控,因此检测了该ETEC菌株包含的黏附素基因fed基因簇和eaeH。fed基因簇的缺失影响细菌的黏附能力,进一步检测野生株和ArcA缺失株与细胞互作后fedA的表达量,发现fedA只在野生株中表达,预示ArcA对其进行正调控,通过EMSA试验证明了 ArcA可以直接和fedA的启动子区域相结合。eaeH的缺失对ETEC的黏附影响不大,arcA的缺失导致了 eaeH基因表达量的升高,说明ArcA对其为负调控。对两种肠毒素ST和LT的研究发现,ArcA在厌氧条件下对eltA是负调控,在有氧条件下对eltA是正调控;而对于热稳定毒素,在有氧和厌氧条件下都是正调控。对溶血素基因的研究证实,ArcA对两种溶血素基因都是正调控作用。FNR对这些基因调控表达的研究证明FNR对eaeH黏附素以及eltA肠毒素为负调控,对其他基因均为正调控作用。这些结果表明ArcA和FNR可以通过对fedA、eaeH、eltA st2、hlyCAB、D、hlyE等毒力基因的直接调控而影响ETEC的致病作用。