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研究发现,哺乳类动物出生后早期心肌细胞仍然具有一定的再生能力,出生后心脏损伤可以激活心肌细胞的细胞周期并参与心肌的完全再生修复。但有关哺乳类动物心肌细胞出生后由增殖向终末分化及其变化发生的精确时间窗尚不明确,同时调控出生后心肌细胞增殖的潜在机制尚不清楚。最近发现,非编码RNAs通过与靶向mRNAs的3-非翻译区(3’UTR)靶向识别结合,在转录后水平调控基因的表达。其中,miRNAs是大约20-24个核苷酸长度的小片段非编码RNAs。越来越多的研究发现,单个miRNAs通过靶向作用于多个生物学功能类似的mRNAs发挥微调的功能。目前,尽管有不少关于miRNAs参与了细胞周期调控的研究报道,但有关哺乳类动物出生后心脏发育期间miRNAs对心肌细胞成熟及终末分化调控的研究却非常少。本实验中,我们通过对大鼠出生后心肌细胞的增殖及miRNAs表达模式进行检测和功能学研究,旨在发现出生后大鼠心肌细胞增殖能力转变过程中参与调控作用的miRNAs。目的：研究大鼠出生后早期心肌细胞的增殖模式,筛选出生后上调明显并参与细胞增殖调控的：miRNAs,明确大鼠出生后大龄心肌细胞中表达上调的miRNAs对心肌细胞增殖能力的影响。方法及结果：第一部分：出生后心肌细胞增殖及miRNA表达检测1.出生后大鼠心肌细胞免疫荧光增殖检测免疫荧光检测大鼠出生后心肌细胞中增殖抗原Ki-67、H3P的表达,计算阳性心肌细胞的数量,绘制大鼠出生后心肌细胞增殖曲线。结果显示,大鼠出生后4周内心脏中存在增殖及有丝分裂的心肌细胞,增殖心肌细胞持续到出生后10天后迅速下降,而有丝分裂心肌细胞出生后持续7天开始下降。2.出生后大鼠心肌细胞microRNA表达谱学检测Affymetrix芯片测定2天(P2)及4周龄(P4W)大鼠心肌细胞中microRNAs (miRNAs)表达。结果显示,P2和P4W心肌细胞之间miRNAs表达差异显著。两组心肌细胞之间表达差异明显的miRNAs共有95个,其中65个miRNAs在P4W组表达下调,30个miRNAs在P4W组表达上调(>2倍)。3.出生后大鼠心肌细胞mRNA表达谱学检测芯片法测定mRNA的表达,结果显示P2与P4W心肌细胞之间mRNAs表达差异明显,P4W组心肌细胞中有1353个基因表达上调,2824个基因表达下调。4.差异表达miRNAs和mRNAs关联的生物信息学分析4.1差异基因显著性功能分析——GO-Analysis基于GO数据库对两组间差异表达基因进行功能注释,发现上调差异基因的显著性功能包括：药物应答、蛋白转运、细胞周期、凋亡及氧化还原反应,而下调差异基因的显著性功能主要包括脂肪酸代谢、β-氧化、电子传递链及离子转运和糖酵解等。4.2基于靶基因功能构建的网络——MicroRNA-GO-Network结合基因功能数据库和靶向序列分析技术构建网络,发现miRNA调控的多种功能。网络中涉及的关键miRNAs,包括miR-34a、139-5p、185、30e、30a、-1、-29a、-195、-499、-133a、-133b.网络中关键的GO,包括：药物反应、低氧反应、氧化还原反应、衰老、细胞增殖正性调控等。差异表达的miRNAs及mRNA进行关联信号网络分析,分别获得细胞周期、细胞增殖调控相关的miRNA-mRNA靶向关联通路。第二部分：miR-29a对心肌细胞增殖的实验研究1.大鼠出生后心脏中miRNAs表达验证分别获的新生2-10天、2周、3周及4周大鼠心肌细胞,qRT-PCR检测miR-1, miR-34a, miR-29a, miR-30e, miR-139和miR-185在心肌细胞及心肌组织中表达。其中,miR-29a表达在出生后的心肌细胞及心肌组织中明显升高,出生后10天尤为明显,持续到出生后4周龄。2. H9c2心肌细胞增殖分析miR-29a、miR-1、miR-34a、miR-30e、miR-139及miR-185模拟剂及拮抗剂分别转染H9c2,24小时后通过MTS法测定H9c2增殖能力。结果显示,miR-29a过表达明显抑制H9c2细胞增殖,而拮抗miR-29a可以促进H9c2细胞增殖。3. miR-29a对心肌细胞增殖的作用研究新生2天心肌细胞分别转染miR-29a模拟剂和拮抗剂,免疫荧光测定心肌细胞增殖、有丝分裂情况,qRT-PCR测定转染后心肌细胞中细胞周期调控基因的表达、流式分析miRNA转染后心肌细胞周期分布。结果显示,miR-29a过表达后降低了增殖及有丝分裂心肌细胞数量,降低了细胞周期调节基因cyclinD2(CCND2)和CDK2的表达,miRNA-29a抑制剂转染后可以促进心肌细胞增殖、有丝分裂及增殖相关基因的表达。流式细胞周期分析,提示拮抗miR-29a的表达可以分别降低G0/G1期心肌细胞的数量,增加S期及G2/M心肌细胞数量。4. miR-29a靶向作用于Cyclin D2(CCND2)蛋白调控心肌细胞增殖Targetscan预测miR-29a靶位点发现CCND2基因是miR-29a高度相关的保守作用位点,荧光素酶基因报告系统检测发现,miR-29a可以降低野生型CCND2基因荧光素酶活性。同样,CCND2蛋白在出生后4周大鼠心肌中的表达明显下降。蛋白免疫印迹检测发现,心肌细胞过表达miR-29a后明显抑制CCND2蛋白表达,而抑制miR-29a的表达可以促进CCND2蛋白表达。结论：新生大鼠心肌细胞具有一定的增殖潜能,这种增殖潜能在出生后4周内逐渐丧失。心肌细胞从增殖向终末分化转变过程中,伴随有miRNA及mRNA表达的改变,出生后上调的miRNA部分参与了细胞周期调控。miR-29a在出生后4周的心肌组织及心肌细胞中表达明显上调并且抑制心肌细胞的增殖。miR-29a通过作用于CCND2调控心肌细胞周期进程,进而调控出生后心肌细胞的增殖和有丝分裂。本研究从心肌细胞增殖的变化及miRNAs表达调控的角度出发,发现心肌细胞增殖潜能消失过程中miRNAs的变化,其中miR-29a在出生后的表达明显上调并可以抑制出生后心肌细胞的增殖,这一发现可能为临床心肌再生提供新的作用靶点。