骨骼是一个不断更新的具有多种功能的器官,包括调节钙平衡,支撑软组织提供造血场所等。这些功能是通过骨组织的不管更新,即重塑而完成的。破骨细胞是唯一具有骨吸收能力的多核细胞。破骨细胞来源于定向的髓系前体细胞。多种细胞及其分泌的因子可以调节破骨细胞的分化及功能,尤其是骨髓基质细胞及其分泌的M-CSF和RANKL。过度的骨溶解是多种病理性损伤中的一个重要的临床问题,如癌症骨转移,类风湿关节炎,骨质疏松以及Paget’s骨病等。因此临床上需要有效的能抑制骨过度溶解或促进骨生成的治疗方法,以预防或减轻骨质疏松的发生,提高病人的生活质量。过去的十年里,在解析破骨细胞生成方面有许多重要的突破,破骨细胞的分化过程及功能越来越清晰。许多因子在这过程中发挥重要的作用,如M-CSF, RANKL, OPG, PU.1以及MITF等。激活转录因子4(ATF4)是一种重要的转录因子,通过定点突变的方法,ATF4最早被发现对于eye lens纤维的形成至关重要。随后越来越多的研究证明其在成骨细胞的分化及骨形成的过程中发挥着重要的作用。有研究证明ATF4可以通过影响成骨细胞产生RANKL的量来间接调节破骨细胞的分化和骨吸收。但是目前尚未见有关ATF4可以直接调节破骨细胞的分化的研究报道。我们认为ATF4可以直接影响破骨细胞的分化。首先,我们通过蛋白印迹的方法以及免疫组织化学染色的方法确立了ATF4在破骨细胞系中的表达,并且通过磷酸酶处理的方法,发现了其磷酸化形式的存在。然后我们利用了功能丧失和获得的方法确立了此因子在破骨细胞形成中的直接作用。在Atf4-/-小鼠的骨中,Trap阳性区域所占的比例明显减小,信号强度也减弱；在体外的分化实验中,由Atf4-/-BMM细胞所形成的多核破骨细胞MNCs(大于等于三个核)的数量也显著减少。而且通过骨片溶解吸收实验(Pitassay)可知,在体外由Atf4-/-BMM所形成破骨细胞的骨吸收凹陷数量也明显减少,但是骨吸收凹陷数目与MNCs数目的比值没有明显的变化,说明ATF4敲除后,破骨细胞的骨吸收能力没有明显改变。在由破骨细胞特异的Trap启动子驱动下,使ATF4在破骨细胞中转基因过表达时,转基因小鼠呈现出明显的骨减少症；血清CTX的水平大幅度升高；破骨细胞的形成在体内和体外都有显著增加,并且与破骨细胞分化相关的基因的表达水平,不论是蛋白水平还是mRNA水平都显著上调。进一步研究发现,由Atf4-/-小鼠的骨髓细胞所形成的GM-CFU的集落数量也明显少于野生型对照组,GM-CFU是具有向破骨细胞分化能力的最原始的造血前体细胞。将Atf4-/-BMM细胞与野生型的成骨细胞共培养或用高浓度的RANKL来刺激其分化,都不能弥补其向破骨细胞分化的缺陷。RANKL的信号是由其受体RANK来传递的。我们通过免疫组织化学染色的方法以及免疫印迹方法发现,在Atf4-/-BMM细胞中,RANK的表达显著降低,并且其mRNA水平也不能被M-CSF所上调。此外RANKL对多条MAPK信号通路的诱导激活也受ATF4的调节。在缺乏ATF4的状态下,RANKL对于三条MAPK的通路的激活能力明显下降,而NF-kB途径、PI3K/Akt途径却不受影响。但是,ATF4对于M-CSF的信号却没有明显的调节作用。到目前为止,NFATcl是破骨细胞分化的最关键基因。无论是在体内还是在体外,ATF4的缺乏都导致NFATcl的表达水平明显下降。用逆转录病毒为载体,使NFATcl在ATF4WT和KO BMM中过表达,可以以剂量依赖性的方式使Trap阳性的MNCs增多。我们利用腺病毒作为载体,在BMM细胞中过表达ATF4,发现ATF4可以以剂量依赖性的方式上调NFATcl蛋白的表达水平。在体外,ATF4可以与NFATcl的启动子结合并能剂量依赖性的激活NFATcl (?)勺启动子,另外,通过ChIP assay的方法可以发现ATF4可以与NFATcl近启动子端的片段相作用并且该作用可以在RANKL的诱导下增强。在BMM细胞中,ATF4的蛋白水平受M-CSF以及PI3K/AKT途径的调节。在缺乏M-CSF的情况下,ATF4的蛋白水平以时间依赖性的方式明显减少,M-CSF可以阻断这一进程。M-CSF的这一作用可以被PI3K/Akt途径的抑制剂LY294002阻断,并且随着LY2094002的浓度的增高,BMM细胞向破骨细胞的分化也相应的受抑制。ATF4的缺乏可以使BMM的分化由破骨细胞系向巨噬细胞系迁移,导致巨噬细胞数量的增多。我们的研究结果证明ATF4在调节破骨细胞分化方面有着重要的内在作用,这也许可以作为治疗与破骨细胞相关的骨疾病的治疗靶点。