Rictor在血管新生及成熟中的作用机制研究

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缺血性疾病如:脑缺血、肢体缺血、心肌缺血等已成为威胁人类健康的杀手之一。目前,促进缺血后血管新生,改善侧支循环来治疗缺血性疾病已成为心血管领域的研究热点。在血管生成至成熟过程中血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)起到极其关键的作用。已有相关研究表明m TOR-Rictor在调节内皮细胞功能中发挥重要作用,但其在血管形成至成熟过程中的作用机制还不明确。本课题前期研究表明Rictor缺失后,小鼠术后缺血区新生血管数量虽有增加但相对正常血管内皮细胞排列絮乱且形态不规则。为了验证Rictor在血管成熟中是否发挥作用及探索其作用机制,本课题通过利用m TOR阻断剂KU0063794及m TORC1阻断剂Rapamycin,缺氧环境下,细胞水平间接推测m TOR-Rictor在缺血后血管成熟中的作用机制,并通过整体动物水平及细胞水平RNA干扰验证m TOR-Rictor在血管成熟中作用。方法:1、原代培养小鼠胸主动脉内皮细胞(mouse aortic endothelial cells,MAECs),用免疫荧光方法鉴定MAECs。采用体外i CELLigence实时细胞分析系统及CCK8试验方法,在正常细胞培养条件下检测KU0063794及Rapamycin对小鼠血管内皮细胞生存率的影响。2、通过Transwell、细胞划痕、细胞成管实验方法研究m TOR-Rictor对小鼠内皮细胞侵袭、迁移、成环能力的影响。3、在缺氧细胞培养条件下,加入不同浓度的KU0063794及Rapamycin,用酶联免疫吸附法检测小鼠内皮细胞培养基上清液中VEGF和ANG1的释放量。4、采用Western Blot技术检测缺氧条件下加入不同浓度KU0063794及Rapamycin后Akt、p-Akt蛋白表达变化。之后检测小鼠血管内皮细胞中Rictor、CX43、PDGF、TGFβ1、Smad3、e NOS、p-e NOS等与血管生成、成熟有关蛋白表达变化。5、shRNA下调MAECs中Rictor表达,western blot检测蛋白Rictor、CX43、PDGF、TGFβ1、Smad3表达;QPCR检测sh RNA干扰后,Rictor、CX43、TGFβ1基因水平变化,酶联免疫法检测培养基上清液ANG1含量。6、小鼠下肢缺血造模,在体干扰Rictor,7天后western blotting法测术侧腓肠肌Rictor蛋白表达变化,同时取小鼠腓肠肌进行冰冻切片,免疫荧光法检测血管新生情况。结果:(1)免疫荧光鉴定原代培养细胞为小鼠胸主动脉内皮细胞;KU0063794及Rapamycin随着浓度升高,对细胞损伤越大。(2)KU0063794处理后细胞迁移、侵袭、成环能力与空白组相比明显下降,有显著性差异(P<0.05)。Rapamycin处理组能抑制细胞迁移、侵袭、成环能力,相对KU0063794处理抑制能力较弱,高浓度之间相比有显著性差异(P<0.05),提示m TOR-Rictor可促进内皮细胞迁移、侵袭、成环。(3)KU0063794组在缺氧环境下,与空白组比较VEGF、ANG1释放量明显降低(P<0.05);Rapamycin处理组与空白组相比,VEGF释放量降低,有统计学差异(P<0.05),ANG1释放量相比空白组差别不大,提示m TOR-Rictor可促进内皮细胞释放VEGF、ANG1。(4)缺氧环境下,较高浓度KU0063794处理组与Rapamycin处理组相比,p-Akt、p-e NOs、TGFβ1、Smad3、CX43、PDGF蛋白表达明显降低(P<0.01),提示m TOR-Rictor可促进p-Akt、p-e NOs、TGFβ1、Smad3、CX43、PDGF蛋白表达。(5)sh RNA下调MAECs中Rictor表达相对成功,下调Rictor后,TGFβ1、CX43、PDGF、Smad3表达显著性下降(P<0.05)。QPCR检测sh RNA干扰后,Rictor,CX43、TGFβ1基因水平明显下调,且Rictor下调后,ANG1释放减少,实验结果加阻断剂后实验结果趋势一致。(6)小鼠下肢缺血造模后,在体干扰Rictor后,小鼠腓肠肌Rictor蛋白表达水平下降,免疫荧光检测新生血管数量有增加,但内皮细胞排列絮乱,提示Rictor可促进血管稳定。结论:实验结果提示,mTOR-Rictor在缺氧环境下能促进内皮细胞中VEGF等相关促血管生成因子释放从而促进血管内皮细胞迁移、侵袭及成管;促进ANG1释放进而促进新生的血管稳定;通过调节与血管形成、稳定、成熟相关信号通路PI3K-Akt-e NOS通路、PDGFR-PI3K-Akt通路、TGFβ1-ALK-Smad通路来促进血管稳定成熟。
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