基于“髓枯骨痿”理论的探讨骨碎补对去卵巢大鼠BMSCs成骨分化的影响及临床应用

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目的:在中医“髓枯骨痿”理论的指导下,探讨绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)的中医学临床特点,并结合历代文献分析,探讨PMOP的基本病机及治疗,探讨骨碎补在防治绝经后女性胸腰椎骨质疏松性压缩骨折术后再骨折的适用性,观察其临床效果,并基于“髓枯骨痿”理论和Wnt/β-Catenin信号通路,探讨骨碎补对去卵巢骨质疏松模型大鼠的骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)成骨分化的影响,从细胞分子的水平研究骨碎补防治PMOP的作用机制,为临床上更好的应用骨碎补提供理论和实验依据。方法:分为三个部分:一、实验研究1.采用雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠作为实验对象,用切除双侧卵巢的方法建立绝经后骨质疏松造模,建立8只去卵巢灌胃组、8只去卵巢空白组、8只假手术组三组作为对照。造模3个月后,行双能X射线骨密度检查(小动物模式),观察其骨量情况。2.制作骨碎补水煎液,称取250g骨碎补中药饮片,加三蒸水至没过中药饮片高度,室温下浸泡30 min,一煎武火煮沸后改文火煎20 min,保留液体;再次加水至没过中药饮片高度,二煎武火煮沸后改文火煎30 min,保留液体,两次煎液合并,双层纱布滤过,浓缩至250ml,分装并-20℃冰箱保存备用。3.每只大鼠按2ml/天灌胃3个月。4.体外培养BMSCs。5.流式细胞表型鉴定。6.碱性磷酸酶染色、茜素红染色。7.Western-Blot检测Wnt/β-catenin信号通路相关成骨蛋白的水平。8.RT-PCR检测相关成骨基因的表达。二、中医文献研究从历代中医学著作中整理对PMOP的认识,在文献中整理“髓枯骨痿”理论,分析PMOP的中医学病因病机,总结历代医家对PMOP的治疗方式,研究骨碎补对PMOP治疗的可行性。三、临床研究(一)选取138例在山东中医药大学附属医院脊柱骨科住院治疗的胸腰椎骨质疏松性压缩骨折术后的女性患者,采集临床基本信息,术前采用全身双能X射线骨密度仪(正常人体模式)测量患者右前臂、左髋关节及腰椎三个部位的骨密度(Bone Mineral Density,BMD)值(≤-2.5cm2/g),观察患者术后的临床症状。(二)对选取患者随机分为观察组和对照组,观察组给予口服强骨胶囊、鲑鱼降钙素、碳酸钙D3片,对照组给予口服鲑鱼降钙素、碳酸钙D3片。两组治疗时间均为6个月。观察临床治疗效果、是否再次骨折、跌倒次数、ODI评分及VAS评分。结果:一、实验研究(一)三组的P0BMSCs接种后24-48小时内贴壁完成,BMSCs开始生长,1-3天基本稳定开始对数繁殖,7-10天达到繁殖的高峰期,14天之后进入平稳期并单层铺满培养瓶底部。(二)流式细胞仪检测结果显示三组细胞均表达CD44、CD29,不表达CD45;成骨诱导显示去卵巢灌胃组的ALP活性较去卵巢空白组强,(三)Western-Blot检测显示去卵巢灌胃组BMSCS的Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白处于开放状态,而去卵巢骨空白组处于相对抑制状态;(四)RT-PCR检测示,β-catenin、LRP-5、OPG三个基因方面卵巢灌胃组表达上调,而SOST基因在表达上两组无明显异常。表明去卵巢灌胃组BMSCs的成骨能力优于去卵巢空白组。二、中医文献研究基于“髓枯骨痿”理论,提出肾精亏虚、筋骨失养是PMOP的关键病机,肾精亏虚是PMOP核心病机,筋骨失养是PMOP重要病机,两者既为标本关系,也为因果关系。故补肾-荣髓-壮骨-强筋是治疗PMOP的基本要求。基于“髓枯骨痿”理论,骨碎补作为补肾壮骨药,适用于PMOP的治疗。三、临床研究胸腰椎骨质疏松性压缩骨折术后患者的临床表现,背部、下腰部或肋部疼痛,术椎局部压痛、叩击痛,但较术前明显减轻。同时兼有骨质疏松症的症状如骨骼疼痛等。故术后病人仍以PMOP为主。PMOP患者以肾精亏虚、筋骨失养证型为主,从补肾-荣髓-壮骨-强筋论治PMOP符合临床实际。再骨折数量方面观察组明显少于对照组,跌倒次数方面观察组少于对照组,VAS评分及ODI评分方面观察组优于对照组。结论:1.去卵巢灌胃组的BMSCs成骨能力较去卵巢空白组增强,补肾-荣髓-壮骨-强筋Wnt/β-catenin信号通路较去卵巢空白组处于相对开放状态,去卵巢灌胃组的成骨基因表达多于去卵巢空白组,从而起到了抗骨质疏松的作用。2.在预防胸腰椎骨质疏松性压缩骨折再骨折方面,强骨胶囊联合碳酸钙D3片可明显提高患者的生活质量、缓解疼痛,减少跌倒次数、相对有效避免再骨折,达到了对PMOP的治疗。3.骨碎补不仅可以使去卵巢骨质疏松大鼠的BMSCs成骨能力增强,其中成药制剂有效的提高了骨骼的负重能力,达到了补肾-荣髓-壮骨-强筋的目的。
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