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研究目的：弓形虫能感染哺乳动物所有的有核细胞，全球约30%的人曾感染弓形虫。天然免疫是抵抗弓形虫感染的第一道防线，天然免疫细胞通过模式识别受体对弓形虫的病原体相关分子模式进行识别和活化，分泌细胞因子和趋化因子从而清除弓形虫感染；同时，弓形虫也分泌毒力因子蛋白抑制天然免疫信号通路从而进行免疫逃逸。弓形虫侵入宿主细胞后形成纳虫空泡，研究报道弓形虫的纳虫空泡可在IFN-γ的作用下破裂，在宿主细胞质中可检测到弓形虫的DNA。细胞质中出现的DNA是非常重要的危险信号，外源性的DNA或者自身DNA在胞质内的积累可触发强烈的天然免疫反应，诱导产生一系列的细胞因子，如IFN-β等。cGAS作为新发现的胞质DNA受体，通过激活STING(干扰素基因刺激分子)、TBK1（TANK结合激酶1）、IRF3（干扰素调节因子3）诱导Ⅰ干扰素产生。基于以上研究背景，本实验旨在研究弓形虫纳虫空泡破裂后，其DNA进入宿主细胞质中能否被DNA受体识别激活下游信号通路，诱导I型干扰素的产生以及对该通路的活化是否依赖于STING、cGAS和TBK1等关键基因，阐明弓形虫感染的胞内天然免疫机制，为理解胞内病原体的天然免疫机制提供新内容。研究方法：1.采用人包皮成纤维细胞（HFF）培养刚地弓形虫ME49-PTG株，抽提弓形虫DNA。HEK293细胞转染弓形虫DNA，用荧光素酶报告基因技术检测IFN-β、ISRE、NF-κB、AP-1基因的启动子表达水平。2.用稳定表达ISRE荧光素酶报告基因的2FTGH细胞测定I型干扰素的蛋白水平和生物活性。3.采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹方法检测转录因子IRF-3二聚体形成和活化。4.通过过表达Sting、cGAS分析Sting和cGAS基因在弓形虫DNA活化通路中的功能。5.弓形虫ME49-PTG株速殖子感染HEK293细胞，用荧光素酶报告基因技术检测IFN-β、ISRE、NF-κB、AP-1基因的启动子表达水平。6. Western Blot鉴定TBK1基因敲除（TBK1-/-）和野生型TBK1+/+的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中TBK1蛋白表达，并以弓形虫速殖子感染TBK1-/-和TBK1+/+MEF细胞，q-PCR检测IL-6、IL-18、STING、ISG15、SAG1等细胞因子基因mRNA的转录变化，分析TBK1基因在弓形虫激活天然免疫中的作用。研究结果：1. HEK293细胞中IFN-β、ISRE启动子的表达随着转染弓形虫DNA量的升高而升高。2. I型干扰素生物活性实验显示：转染弓形虫DNA后，I型干扰素的生物活性显著性增强，说明弓形虫DNA可以诱导I型干扰素的产生，并具有生物活性。3.为进一步揭示弓形虫DNA在感染宿主时的作用机制，我们检测了IFN-β上游信号通路中转录因子IRF-3的活化情况，结果证明弓形虫DNA可以使IRF-3发生二聚化，激活了IRF-3转录因子，说明弓形虫DNA能够通过IRF3激活IFN-β信号通路。4.弓形虫DNA转染HEK293细胞，同时过表达cGAS和STING真核质粒，发现IFN-β启动子的表达量进一步升高，同时I型干扰素生物活性测定显示IFNs活性增强，揭示弓形虫DNA诱导I型干扰素的产生可能通过cGAS-STING信号通路。5.弓形虫ME49-PTG株速殖子可以促进NF-κB启动子的表达，揭示弓形虫可能活化了NF-κB信号通路，而过表达cGAS-STING对NF-κB无影响，同时弓形虫ME49-PTG株速殖子可以轻微激活IFN-β，但对ISRE和AP-1影响不大。6. Western Blot结果鉴定了在TBK1+/+MEF细胞中表达TBK1蛋白，而在TBK1基因敲除的MEF细胞（TBK1-/-）中TBK1蛋白不表达。用弓形虫速殖子感染TBK1+/+MEF细胞和TBK1-/-MEF细胞，q-PCR结果显示，弓形虫内参基因表面抗原蛋白1（SAG1）mRNA转录水平随着时间的增加而升高，说明在小鼠胚胎成纤维细胞中弓形虫的感染和增殖情况；同时，弓形虫速殖子可以抑制IL-6、IL-18、ISG15、STING的mRNA转录。在TBK1-/-细胞感染弓形虫的结果中发现，TBK1基因敲除后，ISG15和IL-18的mRNA水平显著下降；IL-6的mRNA水平有所升高。结论：1.弓形虫DNA能够激活IRF3，使其二聚化，诱导IFN-β的产生，进而促进ISRE的表达，该激活途径有可能通过cGAS-STING信号通路。2.弓形虫速殖子可以促进NF-κB启动子表达，活化NF-κB信号通路。3.弓形虫速殖子可以抑制IL-6、IL-18、ISG15、STING的mRNA转录。TBK1基因在弓形虫速殖子对IL-18、ISG15mRNA转录的抑制作用中起着一定的作用；弓形虫依赖于TBK1基因从而抑制IL-6mRNA的转录。