前言：　　癫痫是一种严重威胁人类健康的可致残性疾病，8‰的人类受到此病的困扰，而癫痫患者约60％于儿童期发病。在儿童癫痫中，经过抗癫痫药系统、正规的治疗仍有约30％的患儿不能得到有效的控制，而发展成难治性癫痫;颞叶癫痫(temporal lobeepilepsy，TLE)是难治性癫痫的主要类型，其发病机制至今尚未完全阐明。目前认为海马硬化是颞叶癫痫的一个显著的病理特征，主要表现为海马萎缩、神经元脱失、胶质细胞增生、齿状回颗粒细胞弥散增宽和苔藓纤维出芽等。癫痫是一种由大脑神经元异常放电所引起的以短暂脑功能异常为特征的慢性脑部疾病，这种神经元的异常放电与神经递质失衡、神经胶质细胞、离子通道、遗传和免疫的异常有着密切的关系。儿童癫痫的发生可能与先天性脑发育障碍、胚胎期脑内信号改变和生后神经网络成熟缺陷等有关，但具体机制不详。有研究表明可能与脑组织调节分子异常，脑组织蛋白质异常聚集等有关，神经营养因子，特别是BDNF，在点燃动物颞叶癫痫模型实验中有显著差异性表达，增加BDNF，明显延迟了癫痫的发生，而敲除其受体TrkB，这个过程被完全阻滞，证明BDNF抑制癫痫过程，是癫痫产生的抑制因素。　　多效生长因子pleiotrophin(PTN)是由Milner等人于1989年从围产期鼠脑组织中纯化得到的一种肝素结合蛋白，其主要的生理功能是刺激细胞增殖与迁移，促进血管生成，促进神经系统及骨发育等。　　星形胶质细胞(astrocyte，AST)可能是中枢神经系统组成成分中对病损最具抵抗力的一种细胞，对神经元有绝缘、支持、摄取化学物质及修复和再生的功能;在几乎所有中枢神经系统的病变过程中，都能观察到AST形态及功能的改变，以星形胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)表达上调和胞核、胞体肥大为特征，表明胶质细胞在中枢神经系统疾病的发生发展过程中扮演了重要角色。　　Wanaka等人的研究了pleiotrophin在大鼠神经系统中的表达，研究结果提示pleiotrophin可能与癫痫的发作有关，然而该研究结果尚待进一步研究。近期研究表明pleiotrophin(Midkine的成分之一)在海人酸诱导的海马癫痫模型中作为一种抗癫痫和神经保护因子存在。　　基于以上研究背景，本研究旨在通过体内体外实验，检测pleiotrophin在氯化锂-匹鲁卡品诱导的大鼠颞叶癫痫模型脑组织中的表达以及戊四唑对体外培养的海马星形胶质细胞中pleiotrophin表达的影响，进一步探讨pleiotrophin的表达改变是否与癫痫的发作有关，为阐明pleiotrophin在癫痫发作中的作用机制提供线索。　　材料和方法：　　一、PTN在癫痫大鼠海马和大脑颞叶皮层中的表达　　取48只日龄11天的SD大鼠幼鼠，分为对照组和实验组，每组24只，每组又按时程分2小时组，3周组，8周组3组，每组8只。实验组参照文献采用氯化锂-匹鲁卡品方法诱导大鼠颞叶癫痫模型，对照组注射等量的生理盐水。实验组中的大鼠分别在癫痫诱导2小时，3周，8周后处死大鼠，对照组注射生理盐水后相同时间处死，取海马组织和大脑颞叶皮层，所有组织一分为二，其中一份经石蜡包埋用于免疫组化和免疫荧光的检测，另一份置于液氮中保存用于real-time PCR和western blot的检测;　　应用免疫组化，real-time PCR和western blot方法检测pleiotrophin在实验组和对照组海马和大脑颞叶皮层中的表达;　　二、PTN在体外培养海马星形胶质细胞中的表达及其对细胞凋亡和增殖的影响　　参照文献方法体外原代培养海马星形胶质细胞并鉴定。用10mM的戊四唑(pentylenetrazole，PTZ)处理体外原代培养海马星形胶质细胞0、1、2、4、8、12和24h，real-time PCR检测各个时间点细胞中PTN mRNA的表达情况;western blot检测细胞中PTN蛋白的表达情况，ELISA检测细胞上清中PTN的表达情况;用0ng/ml、10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml的PTN处理体外原代培养海马星形胶质细胞24h，正常细胞对照，MTT的方法检测PTN对海马星形胶质细胞增殖能力的影响，Hoechst染色的方法检测PTN对海马星形胶质细胞凋亡的影响。　　三、PTN通过NF-κB途径调节海马星形胶质细胞增殖　　细胞样本编号:A、B、C、D代表:细胞对照，细胞+PTN，细胞+BAY11-7028，细胞+PTN+BAY11-7028。　　1、2、3、4代表:细胞+control siRNA，细胞+PTN+control siRNA，细胞+NF-κBp65 siRNA，细胞+PTN+NF-κB p65 siRNA。　　取原代培养海马星形胶质细胞，用NF-κB的特异性抑制剂BAY11-7028(10μmol/L)预处理体外原代培养海马星形胶质细胞2h后，继续用40ng/ml的PTN处理12h，real-time PCR，western blot，ELISA检测细胞中和上清中GFAP的表达情况（注意对照的设置）;用lipofectamine2000转染NF-κB p65 siRNA12h后，用40ng/ml的PTN处理12h，real-time PCR，western blot，ELISA检测细胞中和上清中GFAP的表达情况。　　结果：　　一、PTN在癫痫大鼠海马和大脑颞叶皮层中的表达　　幼鼠自发性癫痫模型建立和行为学观察:90分钟后模型组癫痫动物发作级别均达到Ⅳ-Ⅴ级，给予地西泮10mg/kg腹腔注射以终止癫痫持续状态(status epilepticus，SE)发作，大鼠分别于模型建立2h、3W、8W时间点时，在10％水合氯醛(350mg/kg)深度麻醉，处死各组大鼠，对照组均未发生癫痫行为，同时间点处死大鼠，取大鼠海马及大脑颞叶皮层部分经4％多聚甲醛溶液固定、部分液氮速冻转至-80℃保存用于后续实验。　　免疫组化检测实验组和对照组大鼠海马和颞叶皮层中PTN的表达:PTN阳性细胞位于海马和颞叶皮层中，呈棕黄色。对照组大鼠海马和颞叶皮层中PTN阳性细胞散在分布。模型组大鼠癫痫持续后2小时后海马和颞叶皮层PTN阳性细胞显著表达，而3周，8周阳性细胞表达呈逐渐升高的趋势，与2小时比较差异有显著性(P＜0.01)。　　Real-time PCR检测大鼠海马和颞叶皮层中PTN mRNA的表达:结果显示大脑颞叶皮层中PTN mRNA表达明显增加，与对照组比较差异有显著性(P＜0.01)。海马中PTN mRNA的表达逐渐增加，与对照组比较差异有显著性(P＜0.01)。　　Western blot检测PTN在实验组和对照组海马组织和大脑颞叶皮层中的表达和定位情况:结果显示:鼠海马和颞叶皮层模型组2h、3w、8w PTN蛋白的表达逐渐增加，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。　　二、PTN在体外培养海马星形胶质细胞中的表达及其对细胞凋亡和增殖的影响　　Real-time PCR检测细胞中PTN mRNA的表达情况:戊四唑处理后海马星形胶质细胞中PTN mRNA表达随时间逐渐升高，至8小时达高峰，至24小时维持在较高水平，与对照组比较差异有显著性(P＜0.01)。　　Western Blot检测细胞中PTN蛋白的表达情况:戊四唑处理的海马星形胶质细胞中PTN蛋白表达水平随时间逐渐上升，随时间逐渐增加，8小时达高峰，以较高水平维持至24小时，与对照组比较差异有显著性（P＜0.01）。　　ELISA检测细胞上清中PTN的表达情况:结果显示PTN在戊四唑处理后细胞上清液中表达随时间逐渐上升，8小时达高峰，至24小时维持在较高水平(P＜0.01)。　　MTT检测PTN对海马细胞增殖的影响:结果显示随着PTN浓度的升高，海马星形胶质细胞增殖逐渐增加，PTN促进海马星形胶质细胞增殖。　　Hoechst检测PTN对海马星形胶质细胞凋亡的影响:结果显示随着PTN浓度增加，星形胶质细胞凋亡细胞数减少，PTN抑制海马星形胶质细胞凋亡。　　三、PTN通过NF-κB途径调节海马星形胶质细胞增殖　　Real-time PCR检测抑制剂组和转染组GFAP mRNA的表达情况:NF-κB特异性抑制剂组结果: B组(细胞+PTN)的GFAP mRNA表达水平最高，与A组（细胞对照）比较差异有显著性(P＜0.01);C组（细胞+BAY11-7028）表达水平最低，与A组（细胞对照）比较差异有显著性(P＜0.01);D组(细胞+PTN+BAY11-7028) GFAP mRNA表达明显下降，与B组(细胞+PTN)差异有显著性(P＜0.01); lipofectamine2000转染组GFAP mRNA的表达:通过扩增曲线与标准曲线所得的CT值，用2-△△CT方法计算，结果显示:2组（细胞+PTN+control siRNA）的GFAP mRNA表达水平最高，与1组(细胞+control siRNA)比较差异有显著性(P＜0.01);3组(细胞+NF-κB p65siRNA)表达水平最低，与1组(细胞+control siRNA)比较差异有显著性(P＜0.01)，4组(细胞+PTN+NF-κB p65 siRNA)表达水平明显下降，与2组(细胞+PTN+controlsiRNA)比较差异有显著性(P＜0.01)。　　Western-blot检测NF-κB的特异性抑制剂组和lipofectamine2000转染组中GFAP蛋白的表达:抑制剂组结果显示:正常细胞+PTN组GFAP蛋白含量最高，与正常细胞组比较差异有显著性(P＜0.01);正常细胞+PTN+BAY11-7028组明显下降，与正常细胞+PTN组差异显著(P＜0.01);正常细胞+BAY11-7028组表达下降，与正常细胞组比较差异有显著性(P＜0.05);转染组结果显示:正常细胞+PTN+control siRNA组GFAP蛋白含量最高，与正常细胞+control siRNA组比较差异有显著性(P＜0.01);正常细胞+PTN+NF-κB P65siRNA组蛋白含量明显下降，与正常细胞+PTN+controlsiRNA比较差异有显著性(P＜0.01);正常细胞+NF-κB P65 siRNA组GFAP蛋白表达下降，与正常细胞+control siRNA组比较差异有显著性(P＜0.05)。　　ELISA法检测NF-κB的特异性抑制剂组和lipofectamine2000转染组中细胞上清中GFAP的表达:抑制剂组结果显示:正常细胞+PTN组上清中GFAP蛋白含量最高，与正常细胞组比较差异有显著性(P＜0.01);正常细胞+PTN+BAY11-7028组明显下降，与正常细胞+PTN组差异显著(P＜0.01);正常细胞+BAY11-7028组表达下降，与正常细胞组比较差异有显著性(P＜0.05);转染组结果显示:正常细胞+PTN+controlsiRNA组上清中GFAP蛋白含量最高，与正常细胞+control siRNA组比较差异有显著性(P＜0.01);正常细胞+PTN+NF-κB P65siRNA组蛋白含量明显下降，与正常细胞+PTN+control siRNA比较差异有显著性(P＜0.01);正常细胞+NF-κB P65 siRNA组GFAP蛋白表达下降，与正常细胞+control siRNA组比较差异有显著性(P＜0.05)。　　结论：　　1.PTN阳性染色于海马及颞叶皮层中，呈棕黄色，在大鼠大脑颞叶皮层和海马中PTN表达量随时间逐渐增加。　　2.戊四唑处理的海马星形胶质细胞PTN表达逐渐增加，PTN促进海马星形胶质细胞增殖，抑制细胞凋亡。　　3.PTN通过NF-κB途径促进海马星形胶质细胞的增殖。