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半月板是膝关节重要的构成部分,对于保证膝关节的正常功能有重要意义,半月板缺失会引发膝关节退变加快。组织工程技术是二十世纪末期发展起来的新型学科,组织工程半月板重建有重要的研究和应用前景。
目的:
本研究旨在筛选生物相容性好、材料力学性能优良,并且具有细胞诱导分化作用的支架材料;建立一套简便易行,具有较高临床参考价值的体内组织工程构建半月板的方法;并对各种材料在非关节制动条件下的半月板诱导再生性能进行初步评价。
方法:
第一部分:半月板移植替代材料的制各深低温保存的同种异体半月板经过3次冻融生成脱细胞同种异体半月板(acellular meniscus allograft AMA)。按改进的Urist方法制备兔的干垢端脱钙骨基质(Demineralized Bone Matrix DBM),并以免疫组化法进行DBM中BMP-2的活性检测。根据预试验结果确定的孔径率(60%),以溶液浇铸/粒子沥滤技术制备聚左旋乙酸(Poly-L-1actide PLLA)。
第二部分:动物模型的建立和培育将72只纯种新西兰大白兔,随机分为等分为3个处理组,并在3组中等分为3个时间组。分别对3组动物进行不同支架材料的植入;分期处死动物,取标本进行大体观察、组织学、免疫组化染色观察;将结果进行统计处理,分析比较三种支架材料的组织再生诱导能力和影响因素。
结果:
1、膝关节功能观察三种支架材料植入后主要表现为膝关节的手术创伤反应,未发生组织排异反应,在术后2周左右基本恢复。在术后4、8、12周的被动关节功能检查中三组无明显的差别。
2、三种支架材料在植入后大体观察见:AMA随时间延长逐渐回缩,外形变圆钝;DBM质地逐渐变韧:PLLA在植入后4、8周有脱颗粒现象,质地逐渐变韧,外形无明显变化。在12周AMA组的宽度回缩率达到16.14%,与DBM组(2.74%)、PLLA组(2.91%)相比都有统计学差别(p<0.01),DBM组和PLLA组的回缩率相比没有统计学差别(p>0.05)。
4、组织学观察(1)普通HE染色观察示:4周时增生细胞见于AMA表面及周边1/5区、DBM周边的1/3区;8周时AMA达周边2/3区,在DBM组全层可见增生细胞;到12周时AMA全层可见,但DBM内细胞数量较多。PLLA组全层孔隙在4周时即可见增生细胞,且细胞密度随时间延长逐渐增大。在三种支架材料中只有在PLLA内可见长入的血管,并且在8周时最密集。AMA深层胶原在4周时部分玻璃样变性。
(2)免疫组化示:抗BMP-2染色,在4周时AMA、DBM组阳性细胞主要集中在周边区域;8周时DBM组中全层可见,且集中在游离缘2/3区域;AMA在12周时才全层可见。PLLA组只在12周时在周边区域有非典型表现。统计分析示AMA、DBM两组细胞阳性面积有显著差异(p<0.01):两组内不同时间比较有显著差异(p<0.01)。
抗Ⅰ型胶原染色,PLLA组在4、8、12周均为不连续,散布的结构,未形成明显组织。AMA阳性面积高于DBM,两组有显著差异(p<0.01);AMA组在4、8周比较无统计学差异(p>0.05),12周与4、8周有显著差异(p<0.01);DBM组胶原增长有时问依赖性,4、8、12,周比较有显著差异(p<0.01)。
结论:
1.三种支架材料在兔体内构建膝半月板,均能够诱导生成早期的组织结构。
2.三种支架材料进行体内植入后都具有很好的组织想容性,未对关节的功能造成明显影响。
3、AMA在体内可发生形状的改变和部分变性,影响重建组织的再生和塑形,提示同种异体半月板移植并非理想的半月板重建方法。
4、DBM具有很好的组织诱导分化活性,但刚性不足,影响了组织细胞的长入和组织外形的塑造。
5、PLLA的力学性能好能适应膝关节的要求,窄间结构利于组织长入。在早期种子细胞增生明显,并有新生血管长入,远期组织分化效果尚待观察。
6.在三种支架内重建组织在膝关节的活动状态中可以逐渐完成初步的组织结构乍成和分化,同时膝关节的生物力学作用对重建组织结构和功能初步形成有重要作用,远期效果尚待研究。