第一部分 神经细胞凋亡在急性一氧化碳中毒大鼠脑损伤中的作用及丁苯酞干预的机制研究研究背景及目的:在中枢神经系统损伤中,神经凋亡是一个重要的机制,且神经细胞凋亡,多伴随线粒体的破坏。因此,针对CO中毒凋亡机制,抗凋亡、保护线粒体功能的治疗策略在CO中毒治疗中的作用也得到广泛的研究。丁苯酞(NBP)能减轻类似脑缺血等多种大鼠模型的细胞凋亡所带来的损伤、可以保护线粒体结构和功能的相对正常,在改善神经功能缺损等方面发挥有效的治疗作用。因此,本部分研究通过建立急性一氧化碳中毒大鼠模型,观察中毒前后大鼠脑组织凋亡细胞、凋亡基因以及线粒体功能的动态变化,探讨凋亡机制在CO中毒后大鼠脑损伤中的作用,评价NBP治疗急性CO中毒脑损伤的可行性。研究方法:165只健康成年雄性SD大鼠随机分为三组,每组55只:正常对照组(NC组)、CO组(CO组)和丁苯酞组(NBP组)。CO组和NBP组给予染毒处理,采用吸入法制作急性一氧化碳中毒模型,染毒后两组均给予高压氧治疗。丁苯酞组加用丁苯酞治疗,NC组和CO组口服橄榄油。各组大鼠在设定时间点(造模后1天、3天、7天)运用TUNEL染色法观察凋亡细胞的数量;在设定时间点(造模后6小时、1天、3天、7天)运用RT-PCR法观察凋亡基因Bcl-2及Bax表达;在设定时间点(造模后6小时、1天、3天、7天)运用线粒体膜电位检测法观察线粒体功能等的动态变化,明确丁苯酞对上述指标的影响。统计软件及版本为SPSS 19.0,多组间比较采用ANOVA方差分析,两组间比较采用LSD法检验,当P<0.05时认为结果有统计学意义。研究结果:1.TUNEL法检测显示:NC组可见少量的凋亡细胞,CO组和NBP组凋亡细胞明显增多,与NC组比较,有统计学意义(P<0.05)。与同一时间点同一脑区CO组相比,NBP组凋亡细胞数明显减少,存在统计学差异(P<0.05)。2.RT-PCR法检测显示:NC组中可以检测到Bcl-2 mRNA和Bax-mRNA低水平表达。CO组和NBP组Bcl-2 mRNA和Bax-mRNA表达水平明显升高,与NC 比较,在各个时间点差异均有统计学意义(P<0.05);与同一时间点同一脑区CO组相比,NBP组中Bcl-2 mRNA表达水平明显增高,而Bax mRNA表达水平则明显减低,有统计学意义(P<0.05)。3.线粒体膜电位检测结果:NC组线粒体膜电位处于正常状态。CO中毒后线粒体膜电位水平下降,6小时-1天时线粒体膜电位呈现红色,到第3天时,膜电位呈现绿色,表示明显下降,并一直持续到第7天。相对荧光强度(RFP)检测,NC组大鼠皮质区线粒体RFP值保持较高水平,提示神经细胞线粒体功能完好。相对于NC组,CO组线粒体RFP值在各时间点均降低,在7天时仍维持在较低水平,有统计学意义(P<0.05)。NBP组RFP值较正常NC组各时间点降低(P<0.05),但明显高于CO组,有统计学意义(P<0.05)。结论:1.急性一氧化碳中毒可导致线粒体膜电位的破坏,诱发神经细胞凋亡,从而引起神经功能受损。2.丁苯酞可以减少CO中毒大鼠凋亡细胞的数量,升高抗凋亡基因Bcl-2的表达,降低促凋亡基因Bax的表达,减轻CO中毒引起的线粒体膜电位损伤,抑制凋亡神经细胞、保护线粒体结构和功能的完整性,进而对急性CO中毒脑损伤发挥治疗作用。第二部分 ZO-1和Claudin-5蛋白活性变化在急性一氧化碳中毒大鼠脑损伤中的作用及丁苯酞干预的机制研究研究背景及目的:血脑屏障(BBB)是血管神经单元的重要组成部分,CO中毒导致的脑损伤在发病机制方面与缺氧缺血性疾病有许多共同特征。缺血缺氧后常常引起BBB结构及功能的改变,故CO中毒也可引起BBB损伤及病理性开放。ZO-1和Claudin-5是BBB紧密连接中两个重要蛋白,其表达与BBB功能密切相关。丁苯酞对脑血管病BBB损伤的治疗作用已得到公认,但是否对CO中毒引起的BBB损害也有较好的治疗作用值得进一步探讨。本部分研究目的是通过观察CO中毒后大鼠BBB超微结构改变及BBB紧密连接相关蛋白ZO-1和Claudin-5表达的改变,探讨这两种蛋白在CO中毒后大鼠BBB损伤及NBP干预的作用机制,阐明NBP治疗急性一氧化碳中毒所致的BBB损害的可行性。研究方法:135只大鼠随机分为三组,每组45只:正常组(NC组)、CO组(CO组)和丁苯酞组(NBP组)。CO组和NBP组给予染毒处理,采用吸入法制作急性一氧化碳中毒模型,染毒后两组均给予高压氧治疗。NBP组加用丁苯酞治疗,NC组和CO组口服橄榄油。在设定时间点(1天、3天、7天),使用透射电镜通过硝酸镧示踪法观察各组大鼠BBB超微结构的变化,通过免疫荧光、免疫荧光双标、Western Blot方法观察ZO-1、Claudin-5蛋白的阳性表达以及蛋白量的变化。统计学方法同前。研究结果:1.透射电镜下观察到NC组大鼠BBB结构完整。CO组大鼠在CO中毒后1天和3天出现明显脑水肿和BBB功能障碍,血管壁结构完整性严重破坏,并持续到第7天;给予NBP干预后,各时间点大鼠皮质微血管超微结构损伤明显减轻。2.荧光显微镜下,NC组可见部分ZO-1和大量Claudin-5 阳性细胞。与NC组各时间点相比,CO组ZO-1、Claudin-5阳性细胞数明显减少,蛋白表达明显降低,有统计学意义(P<0.05)。NBP组各时间点ZO-1、Claudin-5 阳性细胞数均较CO组明显增加,蛋白表达也明显升高,有统计学意义(均P<0.05),但与NC组比较,指标未能回到正常(均P<0.05)。3.免疫荧光双标染色结果显示在同一视野下几乎所有Claudin-5阳性细胞都显示ZO-1的阳性免疫反应,但不是所有ZO-1阳性细胞都呈现Claudin-5的免疫源性。表明这两种蛋白不仅可以存在于同一细胞中,而且在不同细胞中也可以单独表达。那些不出现Claudin-5免疫源性的ZO-1阳性细胞可能正是非血管屏障相关的其他类型细胞,如微血管内皮细胞。结论:1.急性CO中毒可损害大鼠BBB的超微结构和功能。2.ZO-1和Claudin-5蛋白是急性CO中毒后BBB的结构和功能损害的重要靶点。3.NBP能通过上调ZO-1和Claudin-5蛋白表达,维持BBB结构和功能的相对完整性,进而显著减轻急性CO中毒引起的脑损伤。NBP将成为急性CO中毒临床治疗的一个新策略。第三部分 Nogo/NgR信号通路相关分子在急性一氧化碳中毒大鼠脑损伤中的作用及丁苯酞的干预研究研究背景及目的:中枢神经系统损伤后再生困难,其主要原因是中枢神经系统微环境中存在轴突生长抑制因子。Nogo/NgR通路相关分子,是轴突生长最重要的抑制因子,它们的激活,抑制了神经的再生及重塑。此外,CO中毒迟发性脑病患者中枢神经系统存在广泛的脱髓鞘病理改变,顶叶皮质区、侧脑室旁白质和苍白球是脱髓鞘改变常见的区域,而且随着中毒时间和程度加重,深部的脑白质和神经核团受损也越来越严重,越容易发生迟发性脑病。Nogo/NgR通路相关分子可能与细胞免疫、炎症脱髓鞘改变密切相关。丁苯酞具有增加缺血区脑血流量和重构缺血区微循环、改善全脑缺血后的能量代谢、抑制血小板聚集、保护线粒体功能、减轻凋亡损伤进而减轻神经功能损伤等效用,本研究拟通过动物实验,观察Nogo/NgR通路相关分子在CO中毒后脑损伤中的作用,探讨NBP是否可通过调节Nogo/NgR通路而起到神经保护作用,为急性CO中毒及迟发性脑病提供新的治疗途径。研究方法:45只大鼠随机分为三组,正常对照组(NC组)、CO组(CO组)和丁苯酞组(NBP组),每组15只。CO组和NBP组给予染毒处理,采用吸入法制作急性一氧化碳中毒模型,染毒后两组均给予高压氧治疗。NBP组加用丁苯酞治疗。NC组和CO组口服橄榄油。各组于设定时间点(1天、7天、28天)运用免疫组化法检测MAG蛋白表达,使用免疫荧光、免疫荧光双标法检测Nogo、NgR1的表达及动态变化,明确丁苯酞对上述指标的影响。统计学方法同前。研究结果:1.MAG蛋白在急性CO中毒后大鼠脑组织中的表达高倍显微镜观察发现,NC组脑组织中少见MAG阳性细胞。CO组中毒初期(1天),可见少量淡染的MAG阳性细胞,散在分布于皮质区。随着中毒后病程的延长,第7天时,MAG阳性细胞数目逐渐增多,至28天时数量较前下降,与NC组相比存在统计学差异(P<0.05);经过NBP治疗后,与NC组比较MAG阳性细胞数量仍明显增多,有统计学意义(P<O.05),与相同时间点CO组相比,虽数量略有减少,但未达到统计学差异(P>0.05)。2.Nogo及NgR1蛋白在CO中毒后大鼠脑组织中的表达在荧光显微镜下,NC组可见Nogo阳性细胞被染成绿色,而NgR1阳性细胞则呈现红色。随着中毒后时间的延长,从第1天到第7天,CO组Nogo及NgR1阳性细胞数目也逐渐增多,在第28天时仍可见较多的Nogo及NgR1阳性细胞,与NC组各时间点相比有显著差异(P<0.05)。经NBP治疗后,Nogo及NgR1阳性细胞数目明显减少,与相同时间点的CO组相比,存在显著的统计学差异(P<0.05),提示NBP能有效抑制CO中毒后Nogo及NgR1表达。结论:1.CO中毒可增加大鼠脑内NgR1、Nogo和MAG蛋白的表达水平,造成神经损害难以修复,而且这三种蛋白在中毒后持续高表达,在中毒后4周仍可观察到,该时间点与迟发性脑病发生时间相符合,因此,这三种蛋白可能与CO中毒后广泛性脱髓鞘损害有关。2.丁苯酞可以通过降低NgR1和Nogo蛋白的表达(而不是MAG),调节Nogo/NgR信号通路的活性状态而发挥神经保护作用。因此NBP可能成为临床上治疗CO中毒急性脑损伤及迟发性脑病治疗有效手段。