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人参果(Solanum lycopersicum L.)原产于南美洲安第斯山脉,与番茄和马铃薯有较近的亲缘关系,其果肉清香多汁、低糖、低脂肪且富含多种矿物质及微量元素(如钙、硒、钼和锌等),具有防癌、抑制心血管病和防龋齿等保健功能,也是糖尿病人的理想水果,但因其适口性和风味不被大多数消费者所喜爱,影响到市场的开发。为了通过转基因技术改良人参果的风味,本研究采用分子生物学方法克隆了全长乙烯应答果实特异性E8启动子,构建了E8启动子驱动的重组甜蛋白基因植物表达载体,并初步完成了人参果组织培养再生体系的建立,为实现甜蛋白基因在人参果果实中特异表达及改善风味奠定了基础。目前取得的研究结果有:1.对来自甘肃省武威市凉州区张义镇日光温室随机采得的人参果果实品质进行了测定,其可溶性糖量为2.71 g/100g,可溶性固形物为6.78 %,Vc 87.11 mg/100g,果实硬度为5.62。与其它水果相比,人参果的Vc含量丰富而可溶性糖含量极低,这可能是造成人参果甜度低、适口性差的主要原因。2.以番茄的基因组DNA为模板,采用基因重叠延伸技术(SOE)克隆到全长2175 bp的番茄果实特异性E8启动子片段。序列分析表明,与GenBank数据库中注册的E8启动子cDNA序列(DQ317599.1)的同源性达99.12 %。3.以质粒pET30a-Bra为模板,亚克隆到Brazzein基因片段并连接至克隆载体。序列分析表明,与重组原Brazzein基因序列同源性达100 %。以pCAMBIA3300为基础载体,成功构建了E8启动子驱动的重组Brazzein基因和含抗除草剂基因bar的植物表达载体pCA-E8-Bra,并成功导入根癌农杆菌C58C1。4.以质粒pMD18-Mab为模板,根据马槟榔甜蛋白(MBLⅡ)核酸序列及相应氨基酸序列的结构及功能预测,采用基因重迭延伸技术(SOE)在编码A链和B链的序列间插入连接多肽LP4/2A,对MBLⅡ基因进行亚克隆并构建重组体。测序结果显示,除连接肽外其余碱基组成与MBLⅡ(ID:D83997)同源性达100 %。以pCAMBIA3300为基础载体,构建了E8启动子驱动的重组MBLⅡ和含抗除草剂基因bar的植物表达载体pCA-E8-Mab,并成功导入根癌农杆菌C58C1。5.选用人参果叶片和单芽茎段为外植体材料,以MS为基础培养基,对激素的浓度和配比进行了优化组合,初步筛选出了人参果再生体系,其中愈伤组织诱导培养基为MS + 30 g/L蔗糖+ 0.2 mg/L 2,4-D + 1 mg/L 6-BA;分化培养基为MS + 30 g/L蔗糖+ 0.1 mg/L IAA + 2 mg/L 6-BA + 1 mg/L ZT + 1 mg/L GA;生根培养基为1/2 MS培养基+ 15 g/L蔗糖+ 1 mg/L NAA。本研究中对于MabinlinⅡ基因的改造方案与现已报道的重组方案均不同,是一次全新的尝试。所选的连接肽LP4/2A的效果已被国内外专家验证,自剪切效率高,氨基酸残留少,不影响两侧基因的定位,产物平衡性好,将其用于马槟榔甜蛋白(MBLⅡ)基因的改造属首次报道。此外,利用E8启动子研究甜蛋白基因在人参果果实中的特异表达,期望利用转基因技术在完全保留人参果独特的低糖、低脂肪,富含Vc、硒、钼等特点及其它一些优良性状的同时,为改善其风味和增加甜度奠定了基础。