论文部分内容阅读
辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus,PMMoV）是烟草花叶病毒属（Tobavmovirus）的一种正链RNA病毒,能够侵染辣椒植株,严重危害辣椒的生长和产量,是世界上威胁辣椒生产的主要病毒之一。在环境监测研究中,PMMoV也可作为指示病毒来监测水体受动物粪便污染的情况。本论文利用分子生物学、免疫学和病毒宏基因组学等方法对PMMoV在辣椒植株、水体及锦鲤组织中的分布进行了研究。主要内容如下:1、以锦鲤为实验材料,取其肠道组织,提取病毒总核酸,利用PCR技术进行随机扩增,然后通过高通量测序对鱼肠道病毒宏基因组进行分析。结果显示测序结果中含有大量病毒特异序列,包括猴疱疹病毒5型（Cercopithecine herpesvirus 5）、辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus）、a 乳头瘤病毒 9（Alphapapillomavirus 9）、花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus）、菜粉蝶颗粒体病毒（Choristoneura occidentalis granulovirus）、肠杆菌噬菌体 P1（Enterobacteria phage p1）、肠杆菌 λ噬菌体（Enterobacteria phage admlba）、大肠杆菌噬菌体 TL201 lb（Escherichia phage TL2011b）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）、人类内源性逆转录病毒（Human endogenous retrovirus）、人类内源性逆转录病毒 H（Human endogenous retrovirus H）、人类内源性逆转录病毒K（Human endogenous retrovirus K）、人类疱疹病毒5（Human herpesvirus 5）和森林脑炎病（Semliki forest virus）病毒序列。这是在鱼肠道组织中发现PMMoV核苷酸序列的首次报道。利用反转录PCR技术,对锦鲤组织中的PMMoV进行了检测,结果显示PMMoV广泛存在于锦鲤的各个组织中。2、以辣椒叶片为试材,提取叶片总RNA,进行反转录PCR扩增,并进一步对扩增产物进行测序。测序结果显示扩增产物为PMMoV特异片段。对辣椒植株的叶片、花药、果实、种子等组织进行冰冻切片,通过原位杂交、免疫组化和免疫荧光等方法对各组织中的PMMoV进行组织定位研究,结果显示在辣椒的各个组织内均有PMMoV的分布。病毒在繁殖组织如花粉粒和种子中存在,可能是病毒传播的主要途径。对叶片、茎、根和花进行全组织原位杂交,结果显示在叶肉细胞和茎的代谢活跃区PMMoV分布明显,在根和花瓣组织中也发现PMMoV分布。原位杂交能够体现PMMoV在辣椒各组织中的分布情况,全组织原位杂交相对于原位杂交能够体现组织宏观特性,可以清楚的体现叶肉细胞、茎的结构、根部细胞及花的整体结构,弥补了原位杂交需要切片而造成的组织及细胞的不完整的不足。两种方法结合可有效分析辣椒植株的不同组织感染PMMoV的特点。3、利用反转录PCR方法对哈尔滨市的马家沟、何家沟、松花江和自来水四种水样进行了 PMMoV检测,结果显示三种水样均呈现PMMoV阳性,而自来水结果为阴性。为了防止PCR的假阳性,还利用斑点杂交技术对PCR产物进行了检测,进一步证实了反转录PCR结果。3个河水水样均检测出PMMoV,说明3处水体已受到粪便的污染,说明PMMoV可能已广泛分布于自然水体中。此外,污染水体中的PMMoV可进一步随水体四处扩散,从而促进了 PMMoV的远距离传播。