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研究背景乳腺癌是威胁女性健康的主要疾病之一,发病率在世界范围内呈上升趋势。由于传统的治疗方法有其自身的局限性,寻找新的疗法迫在眉睫。随着分子生物学及基因工程的迅速发展,基因治疗已成为恶性肿瘤治疗的有效手段之一。自杀基因疗法以其独特的作用机制在乳腺癌治疗中备受关注。联合应用胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)、单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦(HSV-TK/GCV)两大自杀基因系统可以利用两系统的互补作用,提高肿瘤杀伤作用,改善治疗效果,而且可以扩大肿瘤治疗谱,减少耐药现象发生。靶向和高效是基因治疗的关键和瓶颈问题,也是基因治疗能否在临床上得到广泛应用的关键所在。癌组织特异性启动子介导的靶向治疗策略的应用以及超声微泡载体的出现为基因治疗乳腺癌展现出了一个全新的应用前景。KDR启动子在增生活跃的肿瘤血管内皮细胞及多数肿瘤细胞高表达而在正常组织不表达或表达甚微。研究表明,其驱动外源性自杀基因,可使自杀基因在肿瘤血管内皮细胞及肿瘤细胞特异性表达,达到双重靶向治疗的作用,同时减少对正常组织的毒副作用。病毒载体和常用的非病毒载体脂质体分别存在高免疫原性及具有毒性、体内转染率低的不足,而且缺乏靶向性。目前,超声在基因和药物靶向传输中的应用是正在兴起的研究热点。其核心是应用超声波及声学造影剂微气泡发展基因和药物定向传输及释放技术,即超声介导微泡空化靶向传输系统。该系统的原理是将声学造影剂微气泡耦连或包载靶向基因或药物,使载基因或药物微泡在显影组织的同时,利用声学造影剂微气泡在超声场内发生的空化效应,将基因和药物运载和释放到特定的组织和器官,使局部组织达到有效的治疗浓度。已有充分研究证实该系统的可行性和应用前景,其具有全身给药少、局部浓度高、无创、简便、并可在床边进行等优点,给予当前靶向性差、正处于低迷状态的基因疗法以新的希望。目的1.筛选超声微泡介导基因转染人乳腺癌MCF-7细胞的最适参数条件,并检测它作为基因转移技术在MCF-7细胞中的转染效率,探讨该技术用于MCF-7细胞基因转移的可行性。2.采用筛选出的最适超声辐照微泡参数转染含有KDR启动子及CD/TK基因的重组质粒pEGFP-KDRP-CD/TK于高表达KDR的人乳腺癌MCF-7细胞及不表达KDR的人结肠癌LS174T细胞,探讨KDR启动子驱动双自杀基因CD/TK对MCF-7细胞的体外靶向杀伤作用。方法1.以不同超声强度(0.5W/cm2、0.75W/cm2、1W/cm2、1.25W/cm2)及不同超声辐照时间(10s、30s、45s、60s)的超声参数联合一定浓度微泡作用于对数生长期的MCF-7细胞,通过MTT染色,筛选出对细胞活性无明显抑制的超声参数。2.将MCF-7细胞分成5组：①裸质粒组(NP),②声诺维微泡组(MV),③超声组(US),④超声+声诺维微泡组(US & MV),⑤脂质体组(LP)。用上述不同基因转染方式转染pEGFP-C2质粒,通过观察、计数表达绿色荧光蛋白细胞,比较各组转染效率。3.用筛选出的最适超声微泡参数转染含有KDR启动子及CD/TK基因的重组质粒pEGFP-KDRP-CD/TK于表达KDR的MCF-7细胞及不表达KDR的LS174T细胞,通过绿色荧光蛋白表达比较基因转染效率,RT-PCR检测目的基因CD/TK的表达。在前药5-FC和/或GCV作用下,MTT测定肿瘤细胞的生长抑制率,观察自杀基因的协同效应及旁观者效应。结果1.细胞存活率随着超声强度的增强及辐照时间的延长而降低,当超声强度为0.75W/cm2、辐照45s和超声强度1W/cm2、辐照30s时,MCF-7细胞存活率仍>90%,对细胞损伤小,是用于MCF-7细胞基因转染的最适参数。2.五组细胞转染后,超声组和微泡组仅见很少的绿色荧光细胞；而超声微泡组与脂质体组均见大量的绿色荧光细胞,转染率分别为(23.87±2.74)%和(22.03±2.29)%,两者比较没有统计学差异(P＞0.05)；超声微泡组的转染率明显高于单纯超声组或单纯微泡组(P＜0.001)。3.超声辐照声诺维微泡介导pEGFP-KDRP-CD/TK基因转染MCF-7细胞及LS174T细胞后,通过荧光显微镜观察两种细胞均被转染,且转染效率相似,分别为(21.92±3.64)%、(20.97±2.74)%,差异无统计学意义(P>0.05)。4.RT-PCR检测发现,转染pEGFP-KDRP-CD/TK的MCF-7细胞内有CD/TK目的基因的表达,而LS174T细胞未检测到目的基因的表达。5.转染重组质粒的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,单独用前药5-FC、GCV与联合用药细胞抑制率分别为(38.16±1.56)%、(37.29±1.95)%及(61.22±0.70)%,联合用药较单独用药差异具有统计学意义(P<0.001),且各组细胞抑制率均显著高于基因转染率(21.92±3.64)%(P<0.001)；而转染重组质粒的LS174T细胞对前药不敏感,联合用药较单独用药,细胞抑制率无显著差别(P>0.05)。结论1.超声辐照声诺维微泡介导外源基因转染MCF-7细胞的最适超声参数为声强0.75 W/cm2,辐照45s或声强1W/cm2,辐照30s。2.超声微泡是一种安全、高效、靶向的基因传递系统。3.超声辐照声诺维转染pEGFP-KDRP-CD/TK重组质粒于MCF-7细胞和LS174T细胞,二者均具有较高的转染率,且转染率相似。4.KDR启动子可以调控CD/TK双自杀基因在高表达KDR的MCF-7细胞靶向表达。5.前药5-FC和GCV对导入重组质粒的MCF-7细胞具有靶向杀伤作用,且联合用药较单独用药效果明显提高。6.自杀基因治疗系统的杀伤作用机制为对靶细胞的直接杀伤作用及旁观者效应。