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目的:类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是高发病率及致残率的自身免疫病之一。RA的发病机制尚不明确,免疫耐受被打破被认为是其病理过程的重要一环。调节性T细胞（Regulatory T cells,Treg）在维持免疫耐受过程中发挥了重要的免疫抑制功能。叉头盒P3（Forkhead box P3,Foxp3）是Treg细胞的关键转录因子,Foxp3的稳定表达是维持Treg细胞发育、分化及免疫抑制功能的关键分子。大量研究表明,在RA中存在Treg功能及数量异常。在RA炎症状态下,部分Treg会丢失Foxp3表达,甚至会转化为病理性的Th17细胞,其确切机制尚不清楚。肽酶抑制蛋白16（Peptidase Inhibitor 16,PI16）是CAP家族富含94个氨基酸的蛋白,在超过80%以上人CD25+Foxp3+Treg细胞上表达,具体功能知之甚少。我们既往研究发现RA患者的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）、滑膜组织及血清和胶原诱导关节炎（Collagen induced arthritis,CIA）小鼠的脾脏和滑膜组织中PI16高表达。本研究拟明确PI16对RA疾病进展的影响以及对Treg中Foxp3表达的影响及其分子机制。方法:1.PI16对AIA小鼠炎症、骨破坏及Foxp3表达的影响通过构建抗原诱导关节炎模型（Antigen induced arthritis,AIA）,利用HE染色观察AIA小鼠膝关节区域滑膜增生及炎症浸润;应用Western Blot和免疫组织化学染色检测AIA小鼠关节组织中炎性因子的表达;通过SO-FG及T-COL染色分析AIA模型鼠骨破坏情况;采用流式细胞术检测AIA小鼠脾脏淋巴细胞中Treg细胞及Th17细胞比例;通过Western Blot检测AIA小鼠Treg细胞中及膝关节组织中Foxp3的表达。2.PI16通过Bmi-1介导的组蛋白修饰抑制Foxp3表达（1）通过Western Blot、免疫组织化学检测AIA模型小鼠Treg细胞及膝关节Bmi-1的表达;293T细胞过表达Bmi-1和（或）PI16,通过细胞免疫荧光和免疫共沉淀（Co-IP）研究Bmi-1与PI16的相互作用;采用染色质免疫共沉淀（Ch IP）技术检测Bmi-1在Foxp3启动子的富集情况及对组蛋白修饰的影响。（2）分别构建PI16和Bmi-1的截断质粒,293T细胞中过表达不同截断的质粒,通过Co-IP明确PI16与Bmi-1相互作用的具体结构域。（3）通过Bmi-1小分子抑制剂AIA模型小鼠腹腔注射,观察抑制Bmi-1对AIA鼠炎症、骨破坏及Foxp3表达的纠正作用。3.PI16通过抑制K48链接的泛素化修饰影响Bmi-1蛋白的降解293T细胞中过表达His-Bmi-1和Flag-PI16,放线菌酮（CHX）chase法检测对Bmi-1半衰期的影响;293T细胞中过表达His-Bmi-1和（或）Flag-PI16、Ub、Ub-K48、Ub-K63,明确PI16对Bmi-1泛素化降解的影响;构建Bmi-1赖氨酸位点突变体,明确PI16影响Bmi-1泛素化降解的具体位点。结果:1.与野生型小鼠（WT）关节炎小鼠相比,PI16Tg关节炎小鼠表现出明显的炎症、滑膜增生和关节软骨破坏。且PI16Tg关节炎小鼠脾脏淋巴细胞和关节局部组织中Foxp3表达下降,Treg细胞比例下降。2.Western Blot及免疫组织化学显示PI16Tg关节炎小鼠Tregs和关节组织中的多梳蛋白复合物家族（Polycomb Group,Pc G）的Bmi-1明显增加,通过Ch IP实验显示PI16能促进Bmi-1在Foxp3启动子富集,同时促进Foxp3启动子H3K27me3和H2A-K119Ub的抑制性组蛋白修饰。结构域分析显示PI16可以通过169-436区域与Bmi-1的1-95区域相互作用。通过应用Bmi-1小分子抑制剂PTC-209可以减缓AIA小鼠膝关节区域滑膜增生及炎症因子表达,并且减低Bmi-1在Foxp3启动子区域富集,并减少抑制性组蛋白H3K27me3和H2A-K119Ub表达。3.CHX chase法检测显示PI16延长了Bmi-1的半衰期,促进蛋白的稳定性;Co-IP显示PI16通过抑制Bmi-1的73和153赖氨酸位点的K48连接的泛素化降解。结论:PI16通过抑制Bmi-1 K73和K153位点K48连接的多聚泛素化降解,影响Foxp3启动子区组蛋白修饰,从而抑制Foxp3的表达,促进关节炎小鼠炎症及骨破坏。