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背景和目的：胰腺癌是一种临床表现隐匿、恶性程度高、预后极差的消化系统肿瘤。吉西他滨(Gemcitabine, GEM)是目前胰腺癌化疗的一线药物,但化疗耐药问题普遍存在并成为胰腺癌化疗失败的主要原因。新近研究表明热休克蛋白27((heat shock protein27, HSP27))与胰腺癌吉西他滨化疗耐药可能相关,但其确切相关性及机制仍有待进一步研究。本研究旨在探讨HSP27与胰腺癌细胞株SW1990吉西他滨化疗耐药的相关性及可能机制。方法：(1)Western blotting检测耐吉西他滨胰腺癌细胞株SW1990/GEM及其亲本细胞株SW1990中HSP27及磷酸化HSP27的表达情况。分别用0.5、1、2、5、10、μmol/L的吉西他滨作用于SW199048小时(h), Western blotting检测其HSP27的蛋白表达水平。(2)构建HSP27真核表达载体pEGFP-C1-HSP27,并转染SW1990,命名为SW1990/HSP27, Western blotting及RT-PCR检测SW1990/HSP27中HSP27的表达变化。构建HSP27基因的短发夹NA(short hairpin RNA, shRNA)真核表达载体pRNAT-shHSP27,并转染SW1990及SW1990/GEM,分别命名为SW1990shHSP27(+)及SW1990/GEM shHSP27(+), Western blotting及RT-PCR鉴定SW1990shHSP27(+)及SW1990/GEM shHSP27(+)中HSP27的表达情况。(3)细胞增殖-毒性(CCK-8)法检测上调HSP27的SW1990/HSP27对吉西他滨药物敏感性的变化,并用相同方法检测下调HSP27的SW1990shHSP27(+)及SW1990/GEM shHSP27(+)对吉西他滨药物敏感性的改变。(4)流式细胞仪检测吉西他滨诱导下SW1990/HSP27、SW1990shHSP27(+)及SW1990/GEM shHSP27(+)的早期凋亡率的变化。(5)为进一步探讨相关机制,Western blotting鉴定SW1990及SW1990/GEM中Snail、切除修复交叉互补基因1(ERCC1)及E-cadherin的蛋白表达差异,Western blotting检测在SW1990中调高及敲低HSP27对Snail、ERCC1及E-cadherin表达的影响。(6)使用特异性miRNA转染SW1990,命名为SW1990miSnail (+), Western blotting鉴定其Snail、ERCC1及E-cadherin表达的变化,CCK-8法检测敲低Snail对吉西他滨化疗敏感性的影响,并用流式细胞仪检测其对吉西他滨诱导的早期凋亡率的影响。结果：(1)耐药细胞株SW1990/GEM中HSP27及磷酸化HSP27的表达显著高于SW1990(P<0.05),且SW1990中HSP27的相对表达量与吉西他滨呈浓度梯度依赖(P<0.05)。(2)成功构建HSP27真核表达载体pEGFP-C1-HSP27并成功转染SW1990, Western blotting结果提示SW1990/HSP27中有丰富融合蛋白EGFP-HSP27的表达,而未转染组及转染空质粒组均未见表达,RT-PCR示SW1990/HSP27中HSP27的表达明显升高(P<0.05。成功构建针对HSP27的shRNA真核表达载体pRNAT-shHSP27,并成功转染SW1990及SW1990/GEM, Western blotting及RT-PCR证实SW1990shHSP27(+)及SW1990/GEMshHSP27(+)中HSP27的表达均较对应的未转染组及阴性对照组显著下调(P<0.05)。(3)CCK-8证实上调HSP27表达可使SW1990对吉西他滨的敏感性降低,即吉西他滨对SW1990/HSP27的半数抑制浓度(half inhibition concentration, IC50)明显高于转染空质粒组(P<0.05)。下调HSP27的SW1990shHSP27(+)及SW1990/GEM shHSP27(+)对吉西他滨的敏感性显著增加,其IC50值均低于各自阴性对照组(P<0.05)。(4)在0.2μmol/L的吉西他滨诱导24h后,SW1990/HSP27的早期凋亡率明显低于转染空质粒组,而SW1990shHSP27(+)及SW1990/GEM shHSP27(+)的早期凋亡率均高于对应阴性对照组,且差异有统计学意义(P<0.01)。(5) Western blotting证实SW1990/GEM中Snail、ERCC1的表达显著高于SW1990,而E-cadherin的表达明显低于SW1990(P<0.05)。在SW1990中,HSP27的上调可引起Snail、ERCC1蛋白表达的上调以及E-cadherin表达的下调,而HSP27的敲低可导致Snail、ERCC1蛋白表达的下降以及E-cadherin表达的升高,且差异均有统计学差异(P<0.05)。(6)进一步实验证实特异性miRNA可显著敲低SW1990中Snail的表达,且伴随Snail的下调,ERCC1的表达明显下调以及E-cadherin的表达出现明显上调(P<0.05)。 CCK-8提示吉西他滨对SW1990miSnail(+)的IC50值显著低于阴性对照组,且吉西他滨诱导下SW1990miSnail (+)的早期凋亡率明显高于阴性对照组(P<0.01)。结论：HSP27及磷酸化HSP27在耐吉西他滨胰腺癌细胞株SW1990/GEM中呈高表达,胰腺癌细胞株SW1990与吉西他滨呈浓度梯度依赖。HSP27的上调可导致SW1990对吉西他滨敏感性的降低,敲低HSP27可增加敏感株SW1990及耐药株SW1990/GEM对吉西他滨的敏感性。HSP27可能通过Snail进一步调节上皮间质转化相关蛋白(E-cadherin)及ERCC1的表达而影响胰腺癌细胞株SW1990对吉西他滨的敏感性。HSP27在胰腺癌吉西他滨化疗耐药中扮演重要角色,HSP27有望成为胰腺癌吉西他滨化疗敏感性的有效判断指标以及成为吉西他滨耐药胰腺癌的治疗靶点。