论文部分内容阅读
荧光探针是生物传感和荧光成像的有力工具,可以快速、灵敏和方便地提供目标分析物的分布情况、含量信息、动态变化并以可视化方式呈现出来。细胞内的多种生物活性物质参与调节生物体的基本生物过程,许多疾病的产生与这些活性物质的异常表达有着密切联系。此外,这些生物活性物质在不同亚细胞环境中的含量及分子作用机制不尽相同。因此,开发用于检测亚细胞区域生物活性物质的荧光探针,更能准确反映生物活性物质的局部浓度及分布信息,对于监测和阐明生物活性物质参与的各种生理病理过程具有重要意义。萘酰亚胺因其优异的光物理学性能及结构特点,是一种常用于构建各类荧光探针的荧光团。本论文对萘酰亚胺类小分子探针和萘酰亚胺与各种材料结合构建的纳米、聚合物等探针进行了分类介绍,并评述与总结了其在生物活性物质、生物微环境动态变化等方面的荧光成像应用进展。在此基础上,以生物活性气体小分子H2S和甲醛（FA）为分析对象、以萘酰亚胺为双光子荧光团,设计并合成了两亲性荧光探针4-叠氮-6-磺酸钠-N-十六烷基-1,8-萘二甲酰亚胺（ASNHN-N3）、p H激活溶酶体定位双光子荧光探针N-[（4-苯基）-（2,4-二硝基苯磺酸）]-4-[4-（2-氨乙基吗啉）]-1,8-萘二甲酰亚胺（Lyso-NP-DS）和N-[（4-苯氧基）-（4-硝基苯并恶二唑）]-4-[4-（2-氨乙基吗啉）]-1,8-萘二甲酰亚胺（Lyso-NP-NBD）、基于硅点-萘酰亚胺的双光子水溶性纳米荧光探针Si ND-ANPA-N3和基于硅点-萘酰亚胺的线粒体靶向比率型纳米荧光探针Mito-Si ND-NP,并以此开展了亚细胞、细胞、动植物组织、活体内H2S和FA的成像分析与单细胞胞内FA的定量分析。具体研究工作包括:（1）利用新型两亲性双光子荧光探针ASNHN-N3,实现了细胞H2S跨膜释放的可视化监测。ASNHN-N3在萘酰亚胺荧光团N位引入细胞膜靶向基团C16直链烷基、4,6位引入识别基团叠氮和水溶性基团磺酸根,因此荧光团主体定向分布于细胞膜外表面。探针本身荧光量子产率为0.01,与H2S反应后荧光量子产率为0.22。在HEPES缓冲溶液中,37℃,ASNHN-N3与H2S反应仅需10 min完成,检出限为0.75μM,且不受其它生物活性物质干扰。小鼠巨噬细胞（RAW264.7）和人宫颈癌细胞（He La）分别与ASNHN-N3孵育5 min,即可对细胞释放到胞外的H2S进行成像。同时,还对小鼠肝脏和血管组织内源性H2S进行了双光子荧光成像。该方法快速、直观,为研究H2S在生理病理调节机制中的信号转导途径提供了有效的观察平台和技术支撑。（2）基于p H激活溶酶体定位双光子荧光探针Lyso-NP-DS和Lyso-NP-NBD,实现了溶酶体内H2S的准确、高效检测。通过引入两个p H响应基团吗啉和羟基,使两个探针对H2S的荧光响应p H值进一步降低,其H2S衍生物分别在p H 2.5～5.5、p H 3.0～5.5范围内有荧光,与溶酶体的酸性范围（p H 4.0～5.5）更匹配,解决了现有探针荧光响应p H范围偏高的问题。Lyso-NP-DS和Lyso-NP-NBD本身荧光量子产率分别为0.02和0.03,与H2S作用后,荧光量子产率分别增至0.44和0.37。在PBS缓冲溶液中,探针于37℃与H2S衍生完全分别需10 min、15 min,检出限分别为0.20μM、0.36μM。两个探针均成功用于人乳腺癌细胞（MCF-7）和人肝癌细胞（Hep G2）溶酶体内H2S的荧光成像,同时还用于斑马鱼体内外源性H2S的荧光成像。该方法为探究H2S在溶酶体内的具体作用及机制提供了一种更为有效的原位检测及可视化研究工具。同时,提出的设计思路对开发与p H响应相关的荧光探针具有一定的参考作用。（3）采用基于硅点-萘酰亚胺的纳米荧光探针Si ND-ANPA-N3,实现了全水介质中活细胞内H2S的荧光成像。提出利用硅点增进有机小分子探针水溶性、构建无溶剂纳米荧光探针的策略,以水溶性和生物相容性好、表面具有大量氨基的硅点（Si NDs）为载体,通过共价结合,将灵敏度高、选择性好的双光子H2S萘酰亚胺小分子探针ANPA-N3修饰到Si NDs表面。该硅纳米探针的平均粒径为4.4±0.5 nm。在纯水制备的Si ND-ANPA-N3储备液中,ANPA-N3含量约为3.5 mg/m L,而ANPA-N3饱和水溶液中含量约为0.017 mg/m L,表明Si NDs的引入提高了小分子探针的水溶性。在生理条件下,Si ND-ANPA-N3对H2S响应专一,30 min可衍生完全,检出限为0.20μM,且光稳定性好,细胞毒性低,已用于全水介质中He La和MCF-7细胞内H2S的单双光子成像分析及洋葱组织内H2S的荧光成像。该纳米探针合成与提纯过程简单快捷,且兼具硅点与小分子探针的优异性能,为水溶性探针的开发开辟了新途径。（4）通过基于硅点-萘酰亚胺的线粒体靶向比率纳米荧光探针Mito-Si ND-NP,实现了细胞线粒体内FA的比率成像。在上述探针设计基础上,以荧光性能更加优异的硅点为载体和荧光参比,引入线粒体定位基团三苯基膦和FA萘酰亚胺小分子探针部分,制备了平均粒径为4.2±0.66 nm的Mito-Si ND-NP。在380nm下激发,该探针只发出445 nm的硅点蓝色荧光;加入FA后,在545 nm处出现萘酰亚胺的绿色荧光,对FA形成I545/I445比率响应。Mito-Si ND-NP在生理条件下30 min可与FA反应完全,检出限为0.65μM,且不受其它共存活性物质的干扰。与商品化线粒体定位试剂Mito Tracker（?）Red CMXRos共定位实验表明,探针可有效定位于线粒体,并已成功用于全水介质中MCF-7、Hep G2细胞和斑马鱼内FA的荧光成像分析。该工作进一步验证了利用硅点改善小分子探针水溶性策略的可行性,并充分显示了基于硅点的荧光探针在活体生物活性物质成像方面的应用潜力,为发展用于其它亚细胞内目标分析物检测的比率型荧光探针研究提供了新思路。（5）基于双光子探针4-肼基-N-丙基-1,8-萘二甲酰亚胺（NPHNA）生物背景低、光损伤小、深层组织穿透力强等优势,建立了植物组织FA双光子荧光成像分析新方法。将该方法用于拟南芥和油菜叶片内源性FA的成像分析,表明其荧光是由内源性FA所引发的,且荧光在叶片气孔处最强。另外,还对拟南芥根部FA进行了深层组织成像。在此基础上,探讨了非生物胁迫盐、干旱、高低温对拟南芥和油菜叶片以及染病对水稻叶片内FA含量和分布的影响。实验表明,基于双光子探针的荧光成像分析法,在植物生物活性物质成像方面具有明显优势与应用潜力,为这些物质在植物体中的生理、病理功能研究提供了一种原位、无干扰的可视化方法。（6）NPHNA为turn-on型荧光探针,对FA响应灵敏度高、选择性好,将其作为柱前衍生试剂,建立了毛细管电泳分离激光诱导荧光检测单细胞中FA的定量分析方法,并用于单个He La、人脐静脉内皮细胞（ECV-304）和人肝细胞（HL-7702）胞内FA分析。以含有10 m M SDS和15%（v/v）ACN的10 m M Na H2PO4-Na2HPO4（p H 7.4）溶液为背景电解质,5 min内可实现FA衍生物的分离。方法的线性范围为100～17500 amol,检出限为5 amol（S/N=3）。该方法简便、灵敏、快速,为单细胞水平的FA分析及与FA生物学功能相关的研究提供了有效测定方法。