烟草是我国重要的经济作物,每年为国民经济的贡献巨大。但在烟草栽培过程中,经常受到各种生物与非生物的外界胁迫,特别是在我国南方地区,烟草青枯病危害严重,影响了烟草的产量与品质。通过生物技术手段在选育农作物抗逆性品种己经成为研究热点,加速了农作物品种的选育进程。本实验室借助罗氏454测序技术对烟草非生物胁迫转录组进行测序,获得大量数据信息。通过组装、比较分析和功能注释,筛到一批受烟草胁迫相关的抗逆性基因。在获得unigene库的基础上,整合GenBank上烟草已有的UniEST,构建了一张大规模高密度的基因芯片,分析烟草受青枯病诱导的基因表达谱,并在克隆到抗青枯病相关基因NtRLK2的基础上,对该基因进行初步的功能鉴定。1.设立SA、ABA、乙烯利、干旱、低温等胁迫处理及未处理对照两组混合转录组样本,通过罗氏454测序,得到一系列的数据信息,对其进行序列拼接组装、生物学功能注释及分子标记开发,共获得3.9万条unigene,其中1.6万条为未公布的烟草新unigene。在功能基因注释的基础上,筛选出34个烟草抗耐胁迫相关基因,对其在各处理条件下的表达水平进行RT-PCR验证。挑出其中四个表达差异明显的基因,进行组织特性表达以及胁迫处理各时段的进一步验证,从中获得4个抗逆相关基因。2.结合454转录组测序与基因芯片分析结果,预测NtRLK2为抗青枯病相关的RLK候选基因,在已获得NtRLK2基因全长的基础上,从烟草抗病品种系3中克隆其同源基因,通过构建超表达载体和RNAi干扰载体分别转入烟草中感优质品种翠碧一号,对其接种青枯菌进行抗性鉴定,结果与非转基因对照相比,抗性明显增强。其中,RNAi干扰的抗性表现免疫,高于NtRLK2基因超表达的转基因植株抗性。据此,我们初步推测中感品种翠碧一号内存在一个高抗青枯病基因,NtRLK2可能对该抗病基因起抑制作用。