乙烯与AMOS2基因位点在拟南芥响应高铵营养环境中的作用机制

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铵态氮(NH4+)是植物生长发育重要的氮源。为了满足农作物高产的需求,氮肥被大量施用。但是氮肥的过量施用造成氮挥发及NH3/NH4+的沉降,导致土壤NH4+累积。过量的NH4+能够抑制植物生长并降低作物产量。在高NH4+沉降区域,植物地上部暴露于过量的NH4+下会导致敏感物种数量及多样性的减少。然而,人们对植物NH4+毒害分子生理与遗传机制还知之甚少。本文以模式植物拟南芥为材料,运用植物营养学、生理学、遗传学和分子生物学手段,主要研究了高NH4+胁迫对侧根和地上部发育过程的影响。  首先,我们利用拟南芥野生型和乙烯突变体(乙烯不敏感突变体etr1和乙烯过量产生突变体xbat32、eto1)研究了叶部乙烯在地上部高铵调控侧根发育过程中的作用。地上部供铵(SSA)可以同时抑制远根端区和近根端区的侧根发育,但是近根端区和远根端区的侧根发育对高铵的响应存在差异。地上部供铵(SSA)会诱导地上部组织乙烯的积累,增强乙烯报告基因EBS:GUS在地上部的表达,而且拟南芥地上部对高铵的接触是培养基条件下SSA诱导叶部乙烯产生所必需的。乙烯抑制剂可以缓解SSA对侧根数量的抑制,SSA可以更显著抑制乙烯过量产生突变体xbat32的侧根数,而SSA对乙烯不敏感突变体etr1-3侧根数的抑制作用明显弱于野生型,乙烯信号抑制剂(Ag+)可以更显著的缓解乙烯过量产生突变体eto1-1的侧根抑制。抑制增强的地上部乙烯信号或合成可以增强地上部外源IAA对SSA抑制的侧根数的缓解作用,增强的地上部乙烯信号或合成可以抑制地上部AUX1基因的表达。因此,地上部乙烯是高铵条件下侧根发育的负调控者。  其次,我们筛选到一株新的对高铵超敏感的拟南芥突变体amos2((a)(m)monium(o)verly(s)ensitive(2)),该突变体地上部和侧根均表现铵敏感表型:高铵下叶片黄化、缩小,侧根数量抑制明显。通过其它相关离子和其它胁迫实验验证amos2的铵敏感表型是NH4+特异性响应的。amos2铵胁迫下地上部过量累积NH4+,ANOS2基因位点的突变并没有影响GS酶的活性,说明amos2体内铵离子的过量累积并非GS活性被抑制所致。高铵条件下amos2的地上部钾离子含量明显失衡,外源补钾能更显著的恢复amos2突变体地上部的生长并降低其地上部铵离子含量。这说明AMOS2基因位点在高铵破坏植物体内离子平衡,尤其是钾离子平衡的过程中发挥作用。  第三,通过外源添加生长素及乙烯抑制剂实验表明突变体amos2侧根铵敏感或与生长素、乙烯的失衡有关。通过药理学实验验证发现外源添加生长素NAA明显增加了突变体在高铵下的侧根数量,并最终恢复到野生型的水平。外源乙烯抑制剂也明显增加了突变体的侧根数量,且其侧根的增加水平显著高于野生型。这说明生长素或乙烯途径应该参与了突变体amos2的侧根发育对铵胁迫的敏感响应。  第四,应用TAIL-PCR方法克隆到第二条染色体上的候选基因At2g04020和At2g04025。但后期验证实验结果并不支持候选基因At2g04020和At2g04025就是AMOS2。进而应用图位克隆技术初步定位AMOS2基因位点于第一染色体上端C1P42(CER458676)和C1P53(CER464650)标记之间约16-cM的范围内。  最后,我们发现在正常的生长条件下,amos2突变体显示出侧根数量下降、主茎及花发育滞后、果实败育率高及主根伸长改变对生长素的响应特征,说明AMOS2基因位点在控制植物生长发育的某些方面发挥重要作用。  综上述实验结果,地上部接触铵离子是在培养基条件下诱发叶部乙烯积累的关键,叶部乙烯可以负调控高铵胁迫下侧根的发育,且该过程应该有AUX1参与。确定了一株地上部和侧根都表现铵超敏感的拟南芥突变体amos2,明确了一个高铵胁迫下控制离子平衡的遗传位点AMOS2,为进一步研究铵毒害对植物发育的影响提供了有价值的遗传材料和新的切入点。  
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