【摘 要】
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GIGANTEA（GI）作为植物生长发育过程一个重要的基因,它编码一种核蛋白。本实验主要从Cl GI基因及启动子入手研究GI在柑橘成花及干旱胁迫中的功能及调控机制。从柠檬中克隆出Cl GI基因,分别构建了超表达载体、CRISPR载体和其启动子融合GUS蛋白载体,随后进行拟南芥、烟草及柠檬的遗传转化。主要研究结果如下:1.从柠檬中克隆Cl GI基因,测序后发现Cl GI有两个转录本,转录本和剪切本分
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GIGANTEA（GI）作为植物生长发育过程一个重要的基因,它编码一种核蛋白。本实验主要从Cl GI基因及启动子入手研究GI在柑橘成花及干旱胁迫中的功能及调控机制。从柠檬中克隆出Cl GI基因,分别构建了超表达载体、CRISPR载体和其启动子融合GUS蛋白载体,随后进行拟南芥、烟草及柠檬的遗传转化。主要研究结果如下:1.从柠檬中克隆Cl GI基因,测序后发现Cl GI有两个转录本,转录本和剪切本分别命名为Cl GIa和Cl GIβ。Cl GIa由3498个碱基组成共同编码了1166个氨基酸;剪切本Cl GIβ在第9个外显子后保留了282bp的内含子,Cl GIβ由2910个碱基共同编码970个氨基酸,内含子的出现导致翻译提前终止。2.超表达Cl GIa基因转化烟草,发现转基因株系明显早花于野生型株系,且转基因株系气孔密度明显高于野生型,说明Cl GIa基因在开花及逆境中有调控作用。超表达Cl GIa基因转化柠檬上胚轴得到两个超表达系,转化植株叶片细小。构建的CRISPR-GI载体转化柠檬得到一棵带荧光敲除系,检测其靶位点发现两个靶点处均呈多峰现象,且靶点1处检测出PAM前面有两个碱基的缺失现象,说明Cas9蛋白对GI基因进行了编辑。3.通过qRT-PCR检测Cl GI在柠檬的根、茎、叶、花、果等不同组织中的表达情况,发现其主要在叶中表达。将融合GUS蛋白的Cl GI基因启动子在拟南芥中异位表达,并对其不同生长阶段的组织进行GUS染色,发现该启动子主要在叶片中表达,在花、茎等其他器官组织中也有表达。4.对伏令夏橙愈伤进行0、75m M、150m M、300m M、450m M不同浓度的甘露醇处理,定量结果表明随着甘露醇浓度增加,GI表达量呈下降趋势,说明GI响应干旱。同时,对p GI::GUS转基因拟南芥进行干旱处理,GUS染色观察发现随着干旱处理时间越长其染色越浅,说明Cl GI基因可能对干旱敏感。5.应用生物信息学分析柑橘Cl GI基因启动子的主要调控元件,发现其包含MBS、TC-rich repeats等与逆境有关的元件。利用包含这些顺式元件的p GI-abai诱饵载体酵母单杂c DNA文库发现了MYB6与Cl GI启动子互作。
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