目的:构建胶质细胞源性神经营养因子和增强型绿色荧光蛋白双基因表达杆状病毒载体并检测其在体外的表达。 方法:采用分子克隆技术，从Paav－GDNF质粒酶切获得大鼠GDNF目的基因，胶回收目的片段，连接目的基因与载体Pfb－EGFP片段，通过测序明确目的基因成功克隆在载体中。利用Bac－to－Bac杆状病毒表达系统制备穿梭杆粒Bacmid，用PCR方法鉴定Bacmid，脂质体cellfectin转染sf9细胞获取杆状病毒，空斑实验测定病毒滴度，细胞免疫荧光法测定GDNF、EGFP蛋白的表达。 结果:重组质粒BamHI和SalI双酶切后琼脂糖电泳可见640bp处出现特异性条带，证明Pfb－GDNF－EGFP重组质粒构建成功，测序发现基因序列完全正确。用M13引物鉴定Bacmid，产物经琼脂糖电泳见4000bp片段，与预期结构相符；转染sf9细胞扩增后获得病毒滴度为3×1010pfu/ml，sf9中共表达GDNF和EGFP蛋白。 结论:成功构建质粒Pfb－GDNF-EGFP，包装杆状病毒，且获得高滴度的重组杆状病毒，且能共表达胶质细胞神经营养因子以及增强型绿色荧光蛋白。为后续GDNF重组杆状病毒载体应用于内耳基因治疗打下基础。