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禽流感作为重要的人畜共患病,一直以来对养殖业和公共卫生健康造成重大影响。H9N2禽流感病毒感染家禽后虽不会造成很高的死亡率,但被感染的鸡抵抗力降低,导致鸡对其他病原易感而引发二次感染,对家禽养殖业造成重大经济损失。当禽流感病毒感染哺乳动物时其体内的RIG-I和MDA5受体能识别病毒RNA产生天然免疫反应,天然免疫系统的激活会引起下游的信号通路产生级联反应,并释放干扰素(IFN)和多种炎性因子发挥抗病毒效应。有研究表明在鸡的体内缺乏RIG-I受体,但当鸡被禽流感病毒感染时鸡体内同样可产生抗病毒作用的IFN-I。在哺乳动物MDA5的研究中,发现MDA5在抗流感病毒感染过程中可发挥识别病毒RNA并诱导IFN应答的作用,虽鸡的体内存在MDA5受体,但其在抗流感病毒中的功能并不清楚。因此本研究拟通过CRISPR/Cas9技术构建DF1细胞mda5功能失活的细胞系,评价mda5对H9N2禽流感病毒诱导IFN-β及对病毒增殖的影响,为阐释禽流感诱导IFN信号通路及开发适合H9N2流感病毒疫苗株增殖细胞系奠定基础。本研究首先拟通过将既可表达Cas9蛋白又可直接转录sgRNA的质粒转染到细胞完成基因突变,但结果显示在抗生素筛选下细胞均无存活,即该方法未能成功。接着在优化的慢病毒构建体系基础上,通过lenti-CRISPR-v2慢病毒系统构建突变细胞系,但同样构建失败。因此又选择运用两个小骨架慢病毒系统进行构建,首先通过lentiCas9-Blast慢病毒系统构建稳定表达Cas9蛋白的DF1细胞系,经检测可知DF1-Cas9细胞系构建成功;其次通过lenti-Guide-puro慢病毒系统将sgRNA整合入该细胞中,并通过T7E1试验及基因测序验证细胞系功能,结果表明在构建的DF1-Cas9细胞系中可发挥对mda5基因靶向切割的功能。利用对IFN敏感的VSV-GFP荧光病毒进一步筛选mda5基因功能失活的细胞系,结果显示成功实现DF1-?chmda5细胞系的构建。为探究mda5对H9N2诱导的IFN-β及H9N2增殖的影响,因此分别测定了DF1-?chmda5和DF1-Cas9细胞感染H9N2后诱导IFN-β和PKR转录水平。结果显示,DF1-Cas9感染H9N2后,细胞中IFN-β和PKR的转录水平随感染时间的延长呈现上升趋势,表明在H9N2刺激下DF1-Cas9细胞可诱导IFN的应答;在DF1-?chmda5细胞系中也可检测到IFN-β的转录,但其转录水平显著低于DF1野生细胞,表明鸡mda5虽不是禽流感诱导IFN-β和PKR转录的唯一受体,但仍在IFN诱导中发挥主导作用。进一步测定细胞上清病毒的血凝价,结果显示mda5功能失活后可在24h内快速提高H9N2病毒血凝素含量。通过CRISPR/Cas9技术成功构建了稳定表达Cas9蛋白的DF1细胞系;在该细胞系的基础上成功构建mda5功能失活的DF1细胞系;DF1细胞中mda5功能的失活可显著下调H9N2诱导IFN-β的转录,并在短时间内提高H9N2病毒血凝素含量。