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柑橘全爪螨Panonychus citri（Mc Gregor）,别称柑橘红蜘蛛,属蛛形纲（Arachnida）,蜱螨亚纲（Acari）,叶螨科（Tetranychidae）,全爪螨属（Panonychus）,是一类严重危害柑橘的全球性害螨。由于长期不合理用药,加之柑橘全爪螨世代历期短、繁殖能力强等特点,该螨已对多种常用杀螨剂产生抗药性。联苯肼酯和氟啶胺是近年登记用于防治柑橘全爪螨的新型杀螨剂。本研究分析了2种药剂亚致死浓度对柑橘全爪螨生长、发育和繁殖的影响;利用转录组测序,筛选出可能参与柑橘全爪螨对联苯肼酯和氟啶胺解毒代谢相关的差异表达基因,并分析这些基因在柑橘全爪螨不同发育阶段、不同药剂胁迫下的表达模式,初步探索了柑橘全爪螨细胞色素P450基因的真核表达体系。研究结果为联苯肼酯和氟啶胺的科学使用及抗药性机制研究提供了理论依据。1.联苯肼酯和氟啶胺对柑橘全爪螨生长及繁殖的亚致死效应采用生物测定的方法,分析了联苯肼酯和氟啶胺对柑橘全爪螨的亚致死浓度(LC10、LC30和LC50),发现上述两种药剂对柑橘全爪螨卵和雌成螨均表现较高毒力,对雌成螨的毒力均高于卵,且氟啶胺较联苯肼酯的毒力更强。进一步应用生命表分析了不同亚致死浓度(LC10和LC30)联苯肼酯和氟啶胺处理柑橘全爪螨（卵和雌成螨）对其发育繁殖及其种群的影响,联苯肼酯和氟啶胺亚致死浓度LC10和LC30处理柑橘全爪螨的卵后,其雌成螨产卵量显著减少;F0代的内禀增长率rm和周限增长率λ均显著降低。处理柑橘全爪螨雌成螨后,F0代的平均每雌产卵量和寿命均显著减少或缩短,F1代的未成熟期和平均每雌产卵量均显著缩短或减少,F1代的净增殖率R0均显著降低。总体而言,联苯肼酯和氟啶胺亚致死浓度对柑橘全爪螨的生长发育、繁殖和种群增长均有一定程度的抑制作用。2.联苯肼酯和氟啶胺亚致死剂量胁迫下柑橘全爪螨转录组分析联苯肼酯和氟啶胺胁迫下柑橘全爪螨的转录组分析发现,与未处理的柑橘全爪螨相比,联苯肼酯和氟啶胺处理组之间存在188条相同的差异表达基因,在联苯肼酯LC50处理12 h后,柑橘全爪螨有503条差异表达基因（241条基因上调,262条基因下调）;在氟啶胺LC50处理12 h后,柑橘全爪螨有272条差异表达基因（11条基因上调,261条基因下调）。GO富集分析表明,差异基因主要参与生物学过程包括单有机体过程、代谢过程和细胞过程。KEGG通路富集分析表明差异基因在溶酶体和碳代谢通路中显著富集。在联苯肼酯处理组筛选了3条细胞色素P450基因Pc CYP2C15-1、Pc CYP2C31和Pc CYP2C15-2基因;氟啶胺处理组筛选了1条细胞色素P450基因Pc CYP2C15-1,两个处理组有1条共同上调的P450基因。3.候选P450基因在联苯肼酯和氟啶胺亚致死剂量胁迫条件下的表达模式基于柑橘全爪螨转录组数据和二斑叶螨基因组数据,通过PCR技术,成功克隆获得Pc CYP2C15-1、Pc CYP2C31和Pc CYP2C15-2基因c DNA开放阅读框,其长度范围是1503 bp-1545 bp,编码501-515个氨基酸残基,相对分子质量和理论等电点分别为58.02 k Da-59.06 k Da和7.08-8.75。生物信息学分析结果表明,3条P450蛋白具有P450特征区域,且其均属于到CYP2集团。柑橘全爪螨3个候选基因在不同发育阶段的m RNA表达水平检测表明,Pc CYP2C15-1、Pc CYP2C31和Pc CYP2C15-2在不同发育阶段的表达具有特异性。Pc CYP2C15-1和Pc CYP2C15-2则均在成螨期时表达量最高。经过联苯肼酯亚致死剂量LC10、LC30处理12 h后,Pc CYP2C15-1、Pc CYP2C31和Pc CYP2C15-2的表达量均显著上调（P＜0.05）;在联苯肼酯亚致死剂量LC50处理6 h,12 h和24 h后Pc CYP2C15-1、Pc CYP2C31和Pc CYP2C15-2基因的表达量均显著上调。在氟啶胺亚致死剂量LC50处理12h和24h后表达量均显著上调。上述研究结果表明Pc CYP2C31和Pc CYP2C15-2基因在柑橘全爪螨对联苯肼酯的解毒代谢过程中可能具有重要作用,Pc CYP2C15-1基因在柑橘全爪螨对联苯肼酯和氟啶胺的解毒代谢过程中均具有重要作用。4.P450酶体外表达应用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统、双酶切和DNA重组技术,对柑橘全爪螨P450基因（Pc CYP2C15-1、Pc CYP2C31、Pc CYP2C15-2）和P450氧化还原酶基因（CPR）构建了Bacmid-CYP2C15-1、Bacmid-CYP2C31、Bacmid-CYP2C15-2和Bacmid-CPR病毒表达载体,在Sf9细胞中表达重组蛋白,后续对表达产物进行Western-Blot检测时,只检测到了重组的CPR蛋白,而并未检测到3个P450重组蛋白,需要进一步优化真核表达体系。通过草地贪夜蛾Sf21无细胞表达系统对CYP和CPR两种功能蛋白进行表达合成,以p F25K为基础,成功构建重组质粒p F25K::CYP2C15-1和p F25K::CPR表达载体,最后成功表达了2种功能蛋白,为后续联苯肼酯和氟啶胺的体外代谢实验提供了酶源。