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【目的】脊髓损伤作为一类严重的脊柱创伤疾病,具有高致残等特点。目前,其修复仍是医学界的难题。本团队已证实雪旺细胞可以改善脊髓损伤后抑制性微环境促进神经功能的恢复,但伦理学及免疫排斥等问题限制了其临床转化与应用。外泌体被认为是细胞移植的最佳替代方法,本研究拟探讨雪旺细胞外泌体促进神经元轴突再生的分子机制,进一步探讨其在脊髓损伤临床应用中的转化价值,为脊髓损伤的无细胞治疗提供新的方向和理论基础。【方法】1.雪旺细胞的分离、培养与鉴定:本研究将从Wistar大鼠坐骨神经分离雪旺细胞,利用基础培养基、纯化培养基和增殖培养基对雪旺细胞进行培养及纯化,培养至第3-5代(无外泌体血清培养基培养)。利用S-100荧光染色对雪旺细胞进行鉴定。2.雪旺细胞外泌体分离及鉴定:取第3-5代的细胞培养上清液应用贝克曼超速离心机提取外泌体,通过多种方法进行外泌体特征鉴定:扫描电镜观察外泌体的形态及分布;粒径分析检测所提取外泌体直径大小的分布;并通过Western Blot检测表面特异性标志物。3.雪旺细胞外泌体对轴突的影响:利用proBDNF体外模拟脊髓损伤微环境,建立proBDNF诱导的神经元轴索塌陷及凋亡模型,观察干预后神经元存活状况和神经突的生长情况等;使用Image J测量神经元轴突的长度及动态观察轴突变化,确定模型的成功建立。进一步利用免疫荧光和细胞动态观察检测雪旺细胞外泌体对于proBDNF诱导的损伤神经元神经突的影响,利用HCA-Vision Software进行详细分析,包括总神经突长度、最长神经突长度、神经突分支数及神经突根个数。4.RhoA/ROCK信号通路检测:利用Western Blot检测总RhoA,GTP-RhoA,ROCK II及p-CRMP-2的表达水平,明确雪旺细胞外泌体与RhoA/ROCK通路的相关性。【结果】1.成功分离雪旺细胞外泌体:纯化后雪旺细胞中仅有极少量成纤维细胞,且S-100荧光结果示纯化的雪旺细胞可达95%以上。通过改良方案提取的雪旺细胞在电镜下呈杯底状,粒径分析表明直径在40-180 nm之间,平均为106.5 nm,CD9和Alix等特异性标记蛋白阳性,同时表达p75NTR。2.雪旺细胞外泌体促进轴突再生:与Con相比,proBDNF能够在4h和20h明显导致神经元的凋亡和轴突回缩。取4h作为时间点评价神经元存活率和轴突长度发现,proB组的神经元存活率平均为77.4%,轴突长度平均为63.4 nm,与对照组之间的差异具有统计学意义(p<0.05)。动态观察结果表明proBDNF能够在4h内诱导轴突明显回缩,证明了模型的成功建立。进一步分析,proB+Exo组可明显增加损伤神经元总神经突长度(448.87 um)、最长神经突长度(98.53um)和神经突分支数(19.4个),与其他组之间的差异具有统计学意义(p<0.05)。然而各组之间神经突根的个数的差异没有统计学意义(p>0.05)。3.RhoA/ROCK通路关键蛋白检测:proB组和proB+ExD-CM组GTP-RhoA、ROCK II及p-CRMP-2蛋白表达水平均较对照组明显升高(p<0.05)。而proB+Exo组GTP-RhoA、ROCK II及p-CRMP-2蛋白表达水平较proB组有所降低(p<0.05)。总RhoA蛋白表达水平在4组之间的差异没有统计学意义(p>0.05)。【结论】1.本研究成功建立雪旺细胞外泌体分离平台,对雪旺细胞元代分离培养及外泌体提取方案进行优化,利用纯度高达95%的雪旺细胞,通过改良的外泌体提取方案,稳定并高效地从上清液中提取外泌体,为雪旺细胞外泌体在中枢及外周神经损伤修复的研究提供了良好的技术支持。2.本研究发现了雪旺细胞外泌体能够修复神经元损伤,通过探讨雪旺细胞外泌体对proBDNF诱导的损伤神经元的影响,发现雪旺细胞外泌体能够促进损伤局部神经元轴突再生,为雪旺细胞外泌体通过改善微环境促进神经元轴突再生提供了理论基础。3.本研究明确了雪旺细胞外泌体与RhoA/ROCK信号通路的相关性。深入研究雪旺细胞外泌体促进损伤局部神经元轴突再生的机制,推动中枢神经损伤修复由细胞移植向无细胞和无免疫原性的修复方式转变,为未来脊髓损伤的临床修复提供了新方向。