主要研究内容： 一．大鼠骨髓MSCs的生物学特性研究探讨MSCs分离、培养、纯化、扩增、鉴定、标记的方法，研究其生物学特性。 二．大鼠骨髓MSCs体外诱导分化为心肌细胞大鼠骨髓MSCs经5-AZA处理后，在体外定向分化为心肌细胞，并用免疫组化的方法从蛋白水平对诱导后的MSCs进行心肌特异性蛋白表达进行鉴定，确定MSCs在体外能向心肌细胞转化。 三．大鼠骨髓MSCs在体内分化为有收缩／舒张性能的心肌细胞采用特殊的成年大鼠心肌细胞的分离和培养技术，对左前降支冠状动脉(Left anterior descemding coronary artery，LAD)结扎致心肌梗死后MSCs治疗的大鼠进行单个心肌细胞的分离和培养，获得由MSCs在体内分化而来的成熟的心肌细胞，并利用IonOptixTM系统观察其收缩力，对其心肌特异性蛋白desmin、α-sarcomeric actin、troponin I的表达情况进行免疫组化鉴定。 四．大鼠骨髓MSCs在心肌梗死和心肺复苏模型中的应用观察3种不同途径的MSCs治疗(静脉内、左心室内、局部梗死心肌内)对大鼠心肌梗死后心功能的影响及其后CPR的影响，探讨生存于心肌组织中的MSCs能否经受住缺血和再灌注(心跳骤停及心肺复苏)的打击，并维持改善了的心功能，从而为MSCs治疗心血管疾病提供强有力的实验依据。 第一章大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及其生物学特性研究心血管疾病的细胞治疗需要足够数量的干细胞。而骨髓中MSCs数量极少，仅占骨髓细胞总量的0.001～0.01％。如何对这微量的细胞在体外进行分离纯化、大量扩增，从而满足实验及临床细胞治疗所需要的数量，是本章的研究内容。 研究目的: 建立骨髓MSCs的体外分离培养方法，研究MSCs的生物学特性，为进一步诱导分化和实验应用奠定基础。 材料与方法: 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，4±1周龄，在无菌条件下取骨髓，用全骨髓贴壁培养法分离纯化MSCs，传代扩增时控制胰酶消化时间，在相差显微镜下观察细胞形态变化，并采用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD11b／c，CD29，CD44H，CD45，CD90.1表达。观察荧光物质PKH26标记细胞后的染色及生长情况。 小结: 全骨髓贴壁培养法和消化控制相结合能有效地分离纯化大鼠骨髓MSCs，MSCs在体外培养具有很强的扩增能力，第3代的细胞具有很高的纯度又有很强的增殖分化能力，适用于诱导分化研究及细胞治疗。 第二章　骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞及其鉴定 　　MSCs能否分化为心肌细胞是MSCs用于心血管疾病治疗的前提和基础。本章的目的在于证实MSCs在合适的诱导剂的作用下，能在体外诱导分化为心肌细胞，并进行心肌细胞特异性抗体检测。 研究目的: 探讨5-AZA体外定向诱导大鼠骨髓MSCs分化为心肌细胞的潜能，并进行心肌细胞特异性抗体检测，为MSCs移植治疗心血管疾病的实验及临床应用奠定理论基础。 材料与方法: 传代培养的P3大鼠MSCs以终浓度为10μmol／L的5-AZA诱导24h，然后按原培养条件继续培养，逐日观察诱导细胞的形态改变，在诱导后2周时采用免疫组化染色检测心肌特异性蛋白Desmin、α-sarcomeric actin、troponin I的表达情况。 小结: 5-AZA能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化，这为MSCs治疗心血管疾病提供了理论基础。 第三章　骨髓间充质干细胞体内分化为有收缩／舒张性能的心肌细胞及其生物学特性研究 　　骨髓MSCs在体外的诱导分化实验已证实能向成体心肌细胞转化，但在体内是否真的能分化为心肌细胞包括搏动的心肌细胞仍然是目前MSCs移植研究中尚未明确的课题，以前在这方面的研究均是通过免疫组化的方法对心肌组织病理切片内的MSCs进行心肌细胞特异性蛋白的鉴定，来明确所移植的MSCs在体内是否向心肌样细胞的转化，但这些细胞是否能象正常的心肌细胞一样具有收缩／舒张性能，科学界并没有进行证实。本研究利用成年心肌细胞分离和培养的成熟经验，将PKH26标记的MSCs注入梗死部位的心肌内，6周后对治疗后的心脏进行离体消化，获得了由PKH26标记的MSCs分化而来的具有收缩／舒张性能的活的心肌细胞，为MSCs移植治疗心血管疾病提供了关键的证据。研究目的采用特殊的成年大鼠心肌细胞的分离和培养技术，对冠状动脉左前降支结扎致心肌梗死后MSCs治疗的大鼠进行单个心肌细胞的分离和培养，获得由MSCs在体内分化而来的成熟的心肌细胞，并对其收缩力及心肌特异性蛋白desmin、α-sarcomeric actin、troponin I的表达情况进行鉴定。 材料与方法: LAD结扎1周后大鼠开胸并在梗死心肌内局部注射5×106MSCs进行治疗，注射后6周采用特殊的成年大鼠心肌细胞分离和培养技术对治疗后的心脏进行单个心肌细胞的分离和培养。利用IonOptixTM系统，观察和记录了所获得的由PKH26标记的MSCs分化而来的大鼠心肌细胞的长度及收缩／舒张功能，并用免疫组化的方法检测由MSCs分化而来的心肌细胞的特异性抗原表达。 小结: 1.采用特殊的成年大鼠心肌细胞分离和培养技术能分离得到由PKH26标记的MSCs分化而来的心肌细胞。 2.PKH26标记的MSCs分化的心肌细胞具有与正常心肌细胞无异的收缩和舒张功能。 3.PKH26标记的MSCs分化的心肌细胞表达心肌特异性蛋白desmin、α-sarcomeric actin、troponin I。 第四章　骨髓间充质干细胞在心肌梗死和心肺复苏模型中的应用 　　利用细胞移植的方法来增加有功能的心肌细胞的数量，从而改善心功能已成为心血管疾病治疗的新途径。以前的心肺复苏研究使用的均是健康的动物，且研究的重点放在复苏后药物的选择及各种器械如何改进复苏后血流动力学。但临床实际情况是在CPR发生之前病人大多有严重的心脏疾病，因而本课题研究力图尽量接近临床实际，首先结扎LAD，造成较严重的心肌缺血，4周后注射MSCs或PBS，治疗的干预措施提到了CPR之前，治疗4周后再诱发心室颤动(Ventricular fibrillation，VF)及进行CPR，观察MSCs治疗对心肌梗死后心功能及其后的CPR的影响，从而为MSCs治疗心肌梗死及改进CPR的结果提供实验依据，同时，生存于缺血心肌中的MSCs能否经受住第二次缺血缺氧的打击并维持改善的心功能，也是我们研究的重点之一。 研究目的: 观察MSCs对大鼠心肌梗死后心功能的影响及其后CPR的影响，从而为MSCs治疗心血管疾病提供实验依据。 材料与方法: 首先结扎SD大鼠LAD，4周后通过静脉、左心室内、梗死心肌局部3种不同途径注射PKH26标记的5 × 106SCs，注射后2周及4周观察各组心功能改善情况，并在4周时诱导VF及CPR，观察比较CPR时各组血流动力学的改变及复苏后生存时间。 全文主要结论: 1.采用全骨髓贴壁培养法和胰酶消化控制相结合的方法能有效纯化分离大鼠骨髓MSCs。MSCs能在体外迅速扩增，生长性状稳定，体外培养骨髓MSCs可以满足实验研究及临床细胞治疗的需要。PKH126具有很好的染色效果及安全性，是移植细胞体内示踪的较佳选择。 2.大鼠骨髓MSCs在体外经5-AZA诱导后可向心肌细胞转化，诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白desmin、α-sarcomeric actin、troponin I。表明MSCs在一定的条件下可向心肌细胞转化。 3.采用特殊的成年心肌细胞分离和培养的方法可分离得到PKH26标记的MSCs在体内分化而成的搏动的心肌细胞，搏动幅度及心肌特异性蛋白desmin、α-sarcomeric actin、troponin I表达与正常的心肌细胞无异。 4.大鼠心肌梗死后采用3种不同途径(静脉内、左心室内、局部梗死心肌内)MSCs注射治疗，心功能同样明显改善。在CPR过程中及复苏后4h的CI、dp／dt40、-dp／dt、LVDP结果及复苏后的生存时间明显优于对照组。3种不同注射途径治疗后的心脏病理切片发现有大量的PKH26标记的细胞存在，局部心肌内注射组的MSCs数量显著高于静脉内及左心室内注射，但在心功能的改善上，3种不同注射途径没有显著差别。 5.MSCs能经受住第二次缺血缺氧的打击(心跳骤停及心肺复苏)，并维持改善的心功能。