论文部分内容阅读
目的:目前,肺癌的发生和发展仍然是导致癌症死亡的首要原因。临床病理诊断结果表明,大约80~85%的患者为非小细胞肺癌（NSCLC）,而大部分患者确诊时已至ⅢB和Ⅳ期,失去了治疗的最佳时机。最新的研究表明,基因突变可能早于癌症诊断前几年发生。近年来,随着基因组学的发展,临床医生根据患者自身基因突变情况使用靶向药物,选择最佳的治疗方案,提高肿瘤患者的治疗效果以及生存质量。因此,早期诊断和治疗仍然是肺癌研究的重点内容,科研人员通过研究基因在肺癌患者中的表达情况,探讨基因突变的分子机制,从而为临床患者的靶向治疗提供更佳有利的理论证据。近年来,随着分子生物学的兴起,非编码RNA作为肺癌的潜在治疗靶点越来越受到关注。根据国内外研究人员的报道,非编码RNA与非小细胞肺癌的发生发展密切相关。天冬氨酰-t RNA合成酶反义1（DARS-AS1）lnc RNA位于人类染色体2q21.3（chr2q21.3）。既往研究表明,DARS-AS1在甲状腺癌、肾透明细胞癌、前列腺癌和宫颈癌中高表达,并与肿瘤增殖、迁移和侵袭呈正相关。此外,DARS-AS1参与急性髓性白血病和骨髓瘤细胞的发生和发展。上述的研究结果表明,DARSAS1参与了肿瘤的致癌作用;然而,其在NSCLC中的表达及作用机制仍不清楚。研究表明,miRNA是约22个核苷酸的单链非编码RNA,lnc RNA可能充当调节micro RNA（miRNA）的分子海绵或竞争性内源性RNA（ce RNA）。根据文献报道,miR-302a-3p可以抑制肝癌、结肠癌和子宫内膜癌细胞的恶性生物学行为,增强胶质瘤细胞对酪氨酸酶抑制剂的敏感性,并参与调控直肠癌基于5-FU的化疗中自噬的研究。此外,与胰腺癌患者肿瘤大小、组织学分级、血管侵袭性显着相关。然而,miR-302a-3p与NSCLC之间的关系仍不清楚,同时尚未研究NSCLC中DARS-AS1与miR-302a-3p相关的分子机制。根据文献报道,ACAT1在不同的人类癌细胞系中表达增加。ACAT1可以作为前列腺癌预后的标志物,抑制ACAT1的表达还可以减少三阴性乳腺癌细胞的生长。此外,ACAT1参与子宫体癌中阿霉素耐药性的诱导。这些观察结果表明ACAT1是一种潜在的新的抗癌靶点。但目前的研究表明,ACAT1与NSCLC的关系尚未见报道。此外,尚未明确miR-302a-3p是否通过调控ACAT1影响NSCLC恶行行为的作用机制。鉴于上述研究背景,本研究旨在探讨在非小细胞肺癌中,DARS-AS1,miR-302a-3p及ACAT1的表达和生物学行为,证明其在肺癌发展中的作用机制,为肺癌患者的靶向治疗提供理论依据。研究方法:1、本实验以86例临床组织样本以及35对癌与癌旁的组织对,人非小细胞肺癌细胞细胞系（H661、A549、H1299、H460、H292和LK2）和人正常支气管上皮细胞HBE,以及裸鼠皮下移植瘤模型为研究对象。2、通过Real-time PCR实验检测DARS-AS1,miR-302a-3p和ACAT1的m RNA表达水平,通过western blot实验检测ACAT1的内源性表达及AKT/ERK通路相关蛋白的表达及其变化。3、在A549和H1299细胞中,用DARS-AS1-smart silencer和相应的阴性对照转染细胞,进行DARS-AS1敲低实验。瞬时转染miR-302a-3p的模拟物和抑制剂,瞬时转染或干扰ACAT1的表达,获得miR-302a-3p及ACAT1的过表达和敲低的细胞。4、原位杂交实验用于检测DARS-AS1的亚细胞定位。5、双荧光素酶报告基因实验分别验证DARS-AS1与miR-302a-3p的结合位点,以及miR-302a-3p与ACAT1的结合位点。6、RNA免疫沉淀实验验证DARS-AS1与miR-302a-3p的靶向结合关系。7、MTS实验用于检测细胞的增殖能力。8、Transwell实验用于检测细胞的迁移和侵袭的能力。9、利用BALB/c裸鼠移植瘤模型检测DARS-AS1敲除对非小细胞肺癌生长及ACAT1表达的影响。结果:1、通过GEPIA在线数据库分析,DARS-AS1在肺癌组织中高表达。通过检测肺癌临床组织标本,DARS-AS1的表达水平显著高于癌旁组织,临床病理特征分析的结果表明,DARS-AS1高表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期正相关。利用K a p l a n-M e i e r数据库发现,DARS-AS1的高表达,与患者的总生存期负相关。2、通过q RT-PCR实验的检测结果表明,DARS-AS1在非小细胞肺癌细胞系H661、A549、H1299、H460、H292和LK2中的表达水平高于正常支气管上皮细胞HBE细胞。敲低DARS-AS1的表达,抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的生物学行为。3、原位杂交实验验证DARS-AS1主要定位在细胞质中,在线生物学网址分析DARS-AS1含有miR-302a-3p的结合位点。通过q RT-PCR实验证明DARS-AS1负调控miR-302a-3p的表达。双荧光素酶报告基因验证DARSAS1与miR-302a-3p的结合位点。RNA免疫共沉淀实验进一步验证DARS-AS1与miR-302a-3p的靶向结合进而起到miRNAs海绵作用。4、通过q RT-PCR实验检测的结果表明,miR-302a-3p在非小细胞肺癌细胞系H661、A549、H1299、H460、H292和LK2中的表达水平低于正常支气管上皮细胞HBE细胞。过表达miR-302a-3p抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的生物学行为。抑制miR-302a-3p的表达可以逆转DARS-AS1敲低对细胞的抑制作用。5、采用双荧光素酶报告基因验证在线数据库分析的ACAT1的m RNA的3’UTR区与miR-302a-3p之间的结合位点。Western Blot方法检测ACAT1在非小细胞肺癌细胞中高表达,促进细胞的增殖、迁移和侵袭的生物学行为。6、通过q RT-PCR实验以及Western Blot检测,敲低DARSAS1可以抑制ACAT1的m RNA和蛋白的表达,miR-302a-3p负调控ACAT1的m RNA和蛋白表达水平。miR-302a-3p的抑制剂可以逆转DARS-AS1沉默对ACAT1表达的抑制作用。7、通过Western Blot实验检测,miR-302a-3p的模拟物可以抑制AKT/ERK信号通路,ACAT1可以激活AKT/ERK信号通路,ACAT1的过表达可以逆转miR-302a-3p的模拟物对通路的抑制作用。8、裸鼠体内异种移植瘤实验中,注射稳定敲除DARS-AS1的H1299细胞后,与对照组相比,抑制了裸鼠体内成瘤的体积和重量。免疫组化实验证明注射稳定敲除DARS-AS1的H1299细胞后,与对照组相比,降低了肿瘤ACAT1的阳性表达。结论:1、DARS-AS1在肺癌组织中高表达与并与患者的不良预后相关,表明DARSAS1可作为判断预后的标志物。2、敲低DARS-AS1的表达抑制NSCLC细胞的增殖,迁移和侵袭的生物学行为。3、miR-302a-3p在NSCLC中发挥抑癌基因的作用。4、miR-302a-3p与DARS-AS1靶向结合,介导DARS-AS1敲低对NSCLC细胞的抑制作用。5、ACAT1是miR-302a-3p的靶蛋白,在NSCLC中发挥促癌基因的作用6、DARS-AS1负性调控miR-302a-3p进而影响ACAT1的表达水平。7、ACAT1可以激活AKT/ERK信号通路。8、敲除DARS-AS1的表达可以抑制裸鼠移植瘤生长,与体外实验结果一致。