石墨烯(Graphene,G)和氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)材料由于它们特殊的结构和理化性质在生物技术和医学领域得到广泛应用,目前这类纳米材料被证实具有细胞毒性、急性毒性、DNA损伤、发育毒性和神经毒性等。这些纳米材料的体内、体外毒性与其尺寸和氧化状态、暴露浓度和作用时间都密切相关,但对其综合毒性研究报道还比较少。值得注意的是,G和GO材料具有良好的抗菌性,这也是其应用在生物医学领域的优势之一,但这些材料暴露对宿主肠道微生物群和免疫系统的潜在毒性机制尚不明确。本实验选择斑马鱼作为毒理学研究对象,因其为重要模式水生生物,具有生长周期短、繁殖力强、胚胎透明、与人类基因组相似等特征,且无菌(germ-free,GF)斑马鱼模型是研究特种肠道菌株功能的重要工具。本研究制备获得不同尺寸(S:small～30 nm,M:medium～300 nm,L:large～3000 nm)G和GO材料,并通过多种手段检测材料尺寸和氧化状态等表征,然后比较其在细胞、细菌和斑马鱼胚胎/幼鱼的毒性效应和作用机制,旨在利用不同体系对材料体内、体外毒性进行综合评价分析;进一步筛选出毒性较低的中等尺寸GO低浓度暴露成年斑马鱼,揭示其长期生态毒性包括对生长发育指标、肠道菌群和宿主免疫系统的影响,后续将利用无菌斑马鱼模型对材料毒性和肠道菌株进行深入研究,为纳米材料更为广泛安全使用提供检测手段和数据参考。在本研究中,我们利用人类胚肾细胞系(Human embryonic kidney cells,HEK 293T细胞)开展的体外检测发现,不同尺寸的G和GO材料均浓度梯度依赖性地显著降低了细胞的存活率,同时导致细胞DNA损伤,并伴随着ROS产生和损伤应激反应相关基因的激活。此外,细菌实验还表明,G和GO材料对发光菌株Tox2有强烈的急性毒性,G的急性毒性作用高于GO,且具有尺寸大小相关性:L>M>S;而低浓度下中等尺寸GO对发光菌株RecA有明显的遗传毒性。体内实验证明,暴露于50 mg/L浓度的不同尺寸G和GO导致斑马鱼胚胎/幼鱼的发育毒性,包括体长和体重、孵化率和心率的异常变化,以及体内ROS生成和BER、PI3K等信号通路相关基因的激活(特别是GO暴露组)。体内、体外检测综合来看,G具有很强的降低存活率和引起急性毒性的能力,而GO在DNA损伤、ROS产生和基因调控方面的毒性更强。我们的研究结果强调,G和GO的综合毒性是由其物理化学特性,特别是材料大小和氧化状态,以及暴露浓度和体外、体内敏感模型共同作用的。另外,我们筛选出的毒性较低的中等尺寸纳米GO材料在低浓度(0.05,0.5,5 mg/L)暴露25天后,引起雌雄斑马鱼生长发育指标、肠道微生物群组成及免疫系统的紊乱等毒性效应。结果表明,雄性和雌性斑马鱼肠道菌群的组成本身存在明显差异,而且暴露后在菌门和菌属水平的多样性和丰富性均有明显变化。同时,长期暴露GO材料对斑马鱼肠道组织绒毛的发育指标有显著损伤,主要表现为前-中肠部位绒毛长度和宽度的显著降低及杯状细胞数量的显著减少。透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)检测到其超微结构异常,且导致炎症相关细胞比例增加。此外,GO暴露诱导了关键促炎因子包括tnf-α、ifn-γ、nf-κb、tlr-5、il-1β和il-8的表达量上调,同时抑制了 il-4和il-13等抑炎基因的表达,特别是在雄性斑马鱼的肠道组织中。本研究结果表明,低浓度(5 mg/L)GO材料长期暴露降低了成年斑马鱼体内益生菌群的丰度和多样性,导致肠道致病性细菌增多,并诱发肠道组织损伤和激活炎症反应相关基因表达。因此,GO材料的长期暴露对生态环境和生物健康的威胁不容忽视,这些发现为长期低浓度GO材料暴露对宿主炎症和肠道微生物群的影响提供了新思路,以期为环境污染控制标准提供参考。