研究背景：Graves病(简称GD)是一种常见的自身免疫性甲状腺疾病，弥漫性甲状腺肿是其特征性表现之一。患者甲状腺肿越明显，病情越难控制，药物治疗的疗程越长。因此探讨甲状腺肿大的形成机制，研发有效的治疗方法是十分必要的。GD的发病机制与患者血清中存在针对甲状腺细胞膜上促甲状腺激素(TSH)受体(TSHR)的抗体(IgG)，即TRAb有关。TRAb与TSHR结合后，模拟TSH的作用，促进甲状腺细胞增生，导致甲状腺肿大的形成及甲状腺功能亢进。Bojarska曾对GD患者血清TRAb水平和甲状腺大小的相关性进行研究，发现TRAb水平和甲状腺大小正相关。此外，在甲状腺肿大的发生发展过程中，生长因子的作用日益受到重视，其中以胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的作用较为突出。我们前期研究结果显示，GD患者血清和甲状腺组织中的IGF-1水平与甲状腺大小呈正相关，提示IGF-1是一种重要的致肿大因子，参与甲状腺肿大的发生和发展过程。既然TRAb与IGF-1都与甲状腺肿大的发生有关，且TRAb(抗TSHR-IgG)又是GD发生发展的始动因素，故我们推测GD患者甲状腺局部IGF-1水平的变化可能与TRAb的作用有关。从细胞生物学的角度即细胞生长的内在调节来看，甲状腺肿大的发生是由于甲状腺细胞增生和凋亡之间的平衡被打破所致。研究发现在甲状腺组织内存在一种重要的凋亡抑制蛋白—Fas相关死亡域样白介素-1β转换酶抑制蛋白(FLIP)，它可以阻断Fas介导的凋亡信号传导，发挥抑制细胞凋亡的作用，导致细胞增生。有研究发现，在GD患者肿大的甲状腺组织中，FLIP表达增加，导致甲状腺细胞凋亡减少，促进甲状腺肿大的形成；另一方面，细胞周期蛋白D1(cyclin D1)在增殖性甲状腺疾病中的作用也受到很大关注。Cyclin D1是调控细胞增殖的关键蛋白，其基因的过度表达能加速细胞从细胞周期的静止期向分裂期即G1期向S期的转变，促进细胞DNA的复制进程，加速细胞增殖。但是在甲状腺细胞内，IGF-1是否通过影响FLIP、cylinD1的表达及细胞周期的变化从而参与甲状腺肿大发生发展的过程尚不明确。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)是与细胞信号转导有关的第二信使，受到细胞外的刺激即迅速产生。研究发现IGF-1促进多种细胞增殖，抑制细胞凋亡的作用主要通过PI3K途径起作用。PI3K是IGF-1发挥作用的一种关键的调节分子。核因子-κB(NF-κB)是近年发现的转录因子家族中的新成员，是细胞内一种重要的核转录因子，参与多种基因的表达和调控，并在多种刺激介导的细胞信号的转录调控中起核心作用。有研究发现在某些细胞中IGF-1能影响NF-κB的活性，但NF-κB是否参与IGF-1促进甲状腺细胞增殖的过程尚待研究。基于上述研究现状，为了更深入的认识甲状腺自身抗体与IGF-1在GD甲状腺肿大中的作用机制，以便为发现治疗甲状腺肿大的分子靶点提供实验依据，本研究确定研究目的与方法如下：目的：1、通过提取GD患者血清IgG，观察对FRTL-5甲状腺细胞IGF-1基因、蛋白表达及细胞周期的影响；2、通过外源性IGF-1刺激甲状腺细胞，观察IGF-1对FLIP、cyclin D1基因和蛋白表达、细胞周期进展的影响，探讨IGF-1对甲状腺细胞增殖和凋亡相关指标的作用；3、观察IGF-1对NF-κB-DNA结合活性的影响；通过加入NF-κB阻断剂，观察IGF-1影响FLIP和cyclin D1表达的信号传导通路。研究方法：1、甲状腺细胞(Fisher rat thyroid cell line-5，FRTL-5)培养：Coon’s改良的Ham’s F12培养液中加入六种激素-促甲状腺激素10 mU／ml、胰岛素10μg／ml、转铁蛋白5μg／ml、氢化考的松5 ng／ml、生长抑素10 ng／ml、甘氨酸-组氨酸-亮氨酸10 ng／ml及5％胎牛血清，即配成甲状腺细胞培养液，称为6H(hormome)。为使细胞同步化，待甲状腺细胞在培养皿中长至80％～85％时，培养基去除促甲状腺激素和胰岛素，改为其余四种激素加0.2％胎牛血清(称为饥饿培养基，即4H)培养，48小时后吸去培养基，PBS洗两遍，以4H培养基加入不同的处理作用24小时。2、甲状腺体积的测定：分别测量患者甲状腺左、右叶及峡部，包括长径(a)、宽径(b)及厚径(c)，按椭圆公式V(ml)=π／6×a×b×c计算，各部分相加为总体积。3、选择新发GD患者34例、正常对照30例，ELISA法分别测定患者及正常对照血清TRAb滴度。采用PEG4000分别从新发GD患者和正常对照组血清中粗提IgG，其中GD患者又以甲状腺体积40 cm~3为界，分为两组，分别提取血清IgG，各组IgG分别加入培养基中刺激饥饿后的细胞24小时(IgG终浓度100μg／ml)，观察：①IgG对甲状腺细胞形态的影响。②IgG对甲状腺细胞IGF-1mRNA和蛋白表达的影响；4、为探讨IGF-1对FLIP、cyclin D1的作用及涉及的信号通路，将FRTL-5细胞饥饿后分为5组：正常对照组、IGF-1刺激组、IGF-1与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)阻断剂LY294002共培养组、IGF-1与NF-κB阻断剂BAY11-7082共培养组以及IGF-1与两种阻断剂共同处理组。①采用RT-PCR、实时定量PCR检测FLIPmRNA水平变化。②采用Western blot检测FLIP、cyclin D1及NF-κB抑制性蛋白IκBα的蛋白水平。③采用凝胶迁移率测定(EMSA)检测NF-κB-DNA结合活性。5、为探讨IgG及IGF-1对甲状腺细胞细胞周期各阶段的影响，在饥饿后的甲状腺细胞培养基中加入IgG或IGF-1作用24小时，应用流式细胞仪记数细胞周期各阶段的百分数，观察细胞周期的变化。结果：1、TRAb水平与甲状腺肿大的关系：新发GD患者34例，其中30例患者血清TRAb阳性，阳性率为88％(30／34)；正常对照30例，TRAb均为阴性。甲状腺体积较大的患者，血清TRAb水平越高，相关分析显示两者之间呈正相关关系，相关系数为0.7。2、IgG对甲状腺细胞IGF-1水平的影响：与正常对照组相比，GD患者血清IgG能明显上调甲状腺细胞IGF-1的mRNA和蛋白水平；从甲状腺体积超过40 cm~3的患者血清中提取的IgG，与甲状腺体积小于40 cm~3患者的IgG比较，刺激甲状腺细胞IGF-1mRNA和蛋白水平的进一步升高(p＜0.05)。3、IGF-1对FLIP、cyclin D1的影响：IGF-1刺激甲状腺细胞后，FLIP mRNA和蛋白水平明显增加，且随着IGF-1刺激浓度的增高，FLIP表达明显上调。说明FLIP的表达与IGF-1的浓度变化呈剂量依赖性；同样，IGF-1能上调cyclin D1的蛋白水平。加入PI3K阻断剂LY294002后，FLIP mRNA和蛋白水平以及cyclin D1的蛋白水平明显下降。4、IGF-1对NF-κB的影响：加入IGF-1后，与对照组相比，NF-κB的抑制性蛋白IκBα水平明显下降，NF-κB-DNA结合活性明显增加：加入PI3K阻断剂LY294002后，IκBα水平明显升高，NF-κB-DNA结合活性明显下降。5、NF-κB对FLIP、cyclin D1的影响：细胞经IGF-1与BAY11-7082(NF-κB阻断剂)预先作用后，再加入IGF-1刺激，与单独IGF-1刺激组相比，FLIP、cyclinD1蛋白水平明显下降。6、流式细胞记数显示：甲状腺细胞饥饿后，约80％的细胞静止于G0期，经IgG或IGF-1刺激24小时后，S期细胞数目增加，表明细胞进入增殖状态；IGF-1与PI3K阻断剂LY294002或NF-κB阻断剂BAY11-7082共同作用后，与单独IGF-1刺激组相比，S期细胞数目减少，G0期细胞数目增加，表明细胞增殖受抑制。7、细胞形态的变化：饥饿后观察细胞，发现细胞体积缩小，大部分细胞出现空泡，细胞培养液上清中出现漂浮的细胞碎片；加入GD患者IgG或IGF-1作用24小时后观察细胞形态，发现空泡减少，细胞体积增大，状态良好，大部分细胞重新进入增殖状态。结论：1、GD患者血清IgG上调甲状腺细胞IGF-1 mRNA和蛋白水平的表达，且此作用与甲状腺体积大小密切相关；GD患者血清IgG还能刺激甲状腺细胞细胞周期的进展。本研究结果表明，GD患者血清IgG刺激甲状腺细胞增生的作用可能与其上调IGF-1水平有关。2、IGF-1可增加核因子NF-κB的DNA结合活性，降低其抑制性蛋白IκBα的水平，这提示在甲状腺细胞内IGF-1可通过核因子NF-κB影响其调节的靶基因的转录和翻译。3、IGF-1通过影响PI3K和核因子NF-κB，上调抗凋亡蛋白FLIP和细胞周期蛋白cyclin D1的表达水平；同时该信号通路还参与细胞周期的调节；这可能是IGF-1促进甲状腺细胞增殖，抑制其凋亡的机制之一。