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褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal)是水稻的单食性害虫,不仅能够直接刺吸危害造成“虱烧”,还可以传播水稻病毒病草状丛矮病(Grass Stunt)和齿叶矮缩病(Ragged Stunt),对水稻生产造成严重危害。特别是在亚洲水稻种植区,褐飞虱已成为危害水稻生产的头号害虫。目前水稻生产中,使用化学农药仍然是防治褐飞虱的主要手段,但是农药的使用不仅增加生产成本,污染环境,而且促使褐飞虱抗药性增强。因此不断从各种资源中发掘新的抗性基因并且选育抗褐飞虱水稻品种成为防治褐飞虱危害的最经济有效又环保的途径。抗虫基因的分离与克隆,不仅有助于阐明水稻抗褐飞虱的分子机制,而且可以加快其在育种中的应用。本研究对褐飞虱在抗虫品种Rathu Heenati (RH)和感虫品种02428上的取食行为进行了分析,两种排趋性实验结果表明褐飞虱更趋向于在感虫品种02428上取食,因此RH对褐飞虱具有排趋性；强制褐飞虱取食RH后其存活率和蜜露排泄量都低于02428,表明RH对褐飞虱具有抗生性；通过切片观察发现褐飞虱取食RH时形成的能到达维管束的口针鞘的比例低于02428,说明RH抑制了褐飞虱吸取韧皮部汁液。因此抗虫水稻品种RH对褐飞虱取食具有高度的抗生性和排趋性。之前有报道将RH中的Bph3定位于第6染色体,我们通过构建RH和02428的F2群体,在第4染色体短臂检测到一个抗褐飞虱主效QTL；另外构建了RH/02428的BC2F1群体,利用第4染色体两标记和第6染色体两标记分别选择两种类型的单株进行表型鉴定,结果证明本研究所用的材料RH中抗褐飞虱基因确实位于第4染色体而非第6染色体。之后为精细定位Bph3,我们利用RH/02428的F2、BC2F2和BC3F2群体共21,783个单株,利用初定位的标记筛选交换单株,然后进行表型鉴定,最终将Bph3最终定位于两个InDel标记RHD9和RHC10之间约79 kb的物理距离。通过不同网站对79 kb定位区间内的基因进行预测,发现存在3个编码凝集素类受体蛋白激酶(OsLecRKs)的基因,并且在定位区间下游还存在另外一个OsLecRK,这4个基因组成了一个受体蛋白激酶基因簇。受体蛋白激酶在植物抗病响应中作为模式识别受体(PRRs)识别病原菌的激发子,因此我们将4个OsLecRKs基因作为候选基因进行了基因结构和表达量的分析。QTLs检测发现BP348-e-4-2、Sarinah、Lv-7和Lv-4中的抗褐飞虱基因与Bph3等位,测序分析发现上述4个材料和PTB33以及IR72等抗虫品种中OsLecRK1-OsLecRK3氨基酸序列与RH完全一致,与感虫品种9311、日本晴和02428存在较多的差异,包括氨基酸的替换、移码和提前终止等；OsLecRK4在抗虫材料中序列不完全一致,并且对交换单株进行测序发现4个基因可能存在基因的加性效应,其中OsLecRK4对抗性的贡献率最低。qRT-PCR分析表明4个OsLecRKs均受褐飞虱取食的诱导,并且抗感品种间存在差异。以上结果进一步证明OsLecRK1-OsLecRK4可能提供了RH对褐飞虱的抗性。因此我们将这4个基因作为候选基因进行进一步的转基因验证。我们分别构建了4个基因的单基因和多基因互补载体并转入粳稻品种Kitaake,通过对T2代转基因植株的抗褐飞虱表型鉴定发现,转2个基因的植株对褐飞虱抗性比转单个基因抗性增强；转3个基因植株对褐飞虱抗性比转2个基因抗性又进一步增强,因此,我们认为4个OsLecRKs基因对褐飞虱抗性具有累加作用；将4个基因干扰之后,转基因植株对褐飞虱的抗性水平和4个基因的表达水平一致。以上转基因结果进一步证明RH对褐飞虱的高度抗性是由于4个OsLecRKs基因累加作用的结果。同源比较分析发现4个OsLecRKs编码的氨基酸同源性为80.8%,系统树分析表明其都属于G型凝集素类受体蛋白激酶；水稻原生质体亚细胞定位将其都定位于细胞膜上；通过原核表达纯化蛋白后的磷酸化实验表明4个蛋白的激酶结构域都具有Mn2+或Mg+依赖的磷酸化活性；酵母双杂交实验表明OsLecRK2和OsLecRK3的激酶域可发生分子内或分子间的相互作用。以上结果表明本研究中的OsLecRKs属于典型的受体蛋白激酶家族。此外,GUS组织化学染色分析表明4个基因都在褐飞虱取食的部位-维管组织中表达。苯胺蓝染色观察发现褐飞虱取食后能够诱导抗虫品种RH中胼胝质的积累,而在感虫品种02428中则不会积累胼胝质。qRT-PCR分析发现褐飞虱取食后RH和02428中胼胝质合酶基因和水解胼胝质的β-1,3葡聚糖苷酶基因表达并不存在显著差异,我们推测Bph3对胼胝质的调节不在胼胝质合酶和水解酶的转录水平。另外,与野生稻和栽培稻序列比较的结果表明OsLecRK1-OsLecRK4与nivara野生稻同源性更高,在水稻育种过程中并没有被广泛导入栽培稻,因此通过分子标记辅助选择将Bph3位点导入栽培稻宁粳3号,来选育抗褐飞虱新品种。近等基因系R1266对褐飞虱和白背飞虱均具有很好的抗性,表明Bph3位点在生产中具有很好的利用价值。Bph3的克隆为下一步基因的功能分析和全面阐明水稻抗褐飞虱的分子机制奠定了一定的基础；同时有助于研究植物抗虫和抗病的相似性,并且开发与Bph3紧密连锁的分子标记,通过分子标记辅助选择能够提高其在分子育种中的应用效率,为抗褐飞虱水稻品种的选育提供帮助。