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本文从以下几部分进行论述: 第一部分:UbiG蛋白膜结合特性对CoQ合成氧甲基转移过程中甲基供体进入机制的研究 辅酶Q是位于真核生物线粒体内膜和原核生物细胞质膜上的电子传递链中的重要组成部分,对于ATP合成过程中电子由复合物Ⅰ或Ⅱ向复合物Ⅲ的传递发挥着至关重要的作用。UbiG蛋白是一种依赖SAM作为甲基供体的氧甲基转移酶,能够催化大肠杆菌中泛醌合成的两步氧甲基转移反应。之前的研究揭示UbiG蛋白归属于一类独特的膜结合蛋白家族。与典型的Ⅰ类SAM依赖的氧甲基转移酶相比,UbiG蛋白在β4和α10之间具有一段独特的序列插入区,作用于与膜脂的结合。值得注意的是,这段插入序列参与形成了甲基供体结合口袋。然而,此前对获得UbiG蛋白与甲基供体复合物结构的所有尝试都失败了。因此,在氧甲基化过程中UbiG蛋白的膜结合能力与其甲基供体的进入模式两者之间的关系仍是一个值得进一步探究的问题。 在本文中,我们首先揭示了UbiG蛋白的膜结合区域对甲基供体的进入发挥门控作用。当与脂质体结合后,UbiG蛋白与S-腺苷高半胱氨酸(SAH)的亲和力显著增强。我们进一步采用蛋白质工程手段设计多个UbiG突变体蛋白以截断其膜结合区域或是增加其柔性。等温滴定量热实验(ITC)结果表明,与野生型UbiG蛋白相比,这些UbiG突变体与SAH的亲和力发生了显著的提升。此外,我们解析了截断了膜结合区域的突变体UbiGΔ165-187与SAH的复合物结构。根据对结构的分析,我们揭示了UbiG蛋白的甲基供体识别模式。总之,我们的研究结果对认知UbiG膜结合能力与其甲基供体进入模式之间的关系提供了一个全新的角度,同时有助于进一步理解辅酶Q体内合成中氧甲基转移的生物化学过程。 第二部分:新月柄杆菌中SkgA蛋白的结构生物学研究 新月柄杆菌是一种具有独特的不对称分裂性质的属于α-变形菌纲的革兰氏阴性细菌。在它的细胞周期中存在两种具有不同形态和分裂潜能的细胞形式:可分裂的游离形态和不可分裂的固定形态。这种独特的分裂模式对应着一个复杂的控制染色体复制和基因转录时空性的细胞周期调控系统。新月柄细胞周期调控系统具有两条核心信号通路:基于CckA的磷酸基转移信号通路和基于DivJ/PleC调节DivK磷酸化的信号通路。其细胞周期的调控由4个全局性调控因子DnaA、CtrA、CcrM和GcrA主导完成,它们能够控制下游约几百个细胞周期相关靶基因的表达。 SkgA蛋白是新月柄杆菌中第一个被发现的针对过氧化氢压力的饥饿应答调控子,研究表明SkgA蛋白对碳源缺乏情况下促进过氧化氢酶-过氧化物酶katG蛋白的表达和抵抗过氧化氢压力中发挥着重要的作用。同时,根据序列分析结果,SkgA属于MerR型HTH转录调控因子家族,具有一个典型的螺旋-转角-螺旋DNA结合结构花样,因而推测它具有类似MerR家族其它成员的转录调控作用。然而,目前对SkgA蛋白功能的研究主要局限于饥饿应答调控领域且尚不完善,同时SkgA蛋白在转录调控中的功能尚不清晰,是否参与细胞周期调控以及在细胞周期调控中发挥什么作用有待进一步研究。 在本文中,我们构建了skgA的重组表达质粒,表达,纯化出野生型SkgA和硒代甲硫氨酸SkgA蛋白并进行了晶体筛选和优化,通过X射线衍射实验最终获得了2.7埃的Native蛋白和3.26埃的硒代蛋白的衍射数据。本工作对后续的结构解析工作奠定了基础,我们对SkgA蛋白进行的结构生物学研究将有助于进一步挖掘其潜在的功能。