EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)属于疱疹病毒γ亚科嗜淋巴细胞病毒成员，在世界各地广泛分布，为95％以上的成人所携带，是较早认识的与人类肿瘤相关的病毒。自1966年Old在鼻咽癌(nasopharyngeall careinoma，NPC)组织中首先发现存在有EB病毒DNA以来，大量的血清流行病学研究已证明EB病毒与鼻咽癌有关。鼻咽癌是上皮来源的恶性肿瘤，高发于东南亚及我国华南地区。临床上鼻咽癌通常不宜手术治疗，放疗、化疗后也不能完全有效清除肿瘤细胞，部分患者易复发和转移，并且治疗产生的副作用又影响了自身的免疫系统。因此目前，在倡导鼻咽癌综合治疗的同时更加注重免疫治疗。对鼻咽癌的免疫机制研究显示，针对EB病毒特异性细胞毒性T细胞(CTL)细胞在清除肿瘤细胞中起着关键作用。CTL亚群能直接识别并杀伤肿瘤细胞，在杀伤肿瘤细胞中CD4~+和CD8~+T细胞相互协调共同发挥作用。以CTL为基础的免疫治疗需选择合适的靶抗原。鼻咽癌肿瘤细胞中EB病毒蛋白呈潜伏Ⅱ型表达，即仅表达低免疫原性抗原EBNA1、LMP1、LMP2。EBNA1在诱导特异性T细胞的同时，也能诱导CD4~+调节性Treg细胞，抑制机体的免疫应答，且EBNA1记忆性CTL反应主要受HLA B3501，B7等限制。LMP1已被确认为能够使正常细胞发生转化癌基因蛋白，CTL识别的靶位易突变，免疫原性也弱于LMP2。目前认为，LMP2A是免疫治疗理想的靶抗原，序列相对保守，具有潜在性的T细胞表位。在NPC病人血液中能检出针对EB病毒LMP2的CTL前体细胞，但其数目及反应性明显低于健康携带者，导致机体对肿瘤的免疫耐受。所以纠正这种CTL的低应答状态对于机体有效清除肿瘤细胞至关重要，诱导EBV特异性CTL是鼻咽癌免疫治疗的关键。T细胞只能识别由抗原递呈细胞(APC)递呈的抗原肽-MHC分子复合物。树突状细胞(DC)是目前发现功能最强的APC，能激发初始型和记忆型T细胞，产生有效的CTL应答。以DC为基础的免疫治疗已在许多肿瘤的治疗中取得了良好的效果，是当前抗肿瘤免疫治疗研究的热点之一。本课题用DC作为鼻咽癌免疫治疗的APC，选用EB病毒LMP2A作为免疫治疗的靶抗原，以分子生物学和细胞生物学方法构建LMP2A稳定表达细胞株，纯化LMP2A蛋白，并对EBV相关的NPC病人的血清进行了检测；蛋白负载经体外扩增的EB病毒阳性健康携带者的DC；负载的DC分别与自体外周血CD4~+和CD8~+T混合培养，激发出LMP2A特异性CD4~+和CD8~+T，并对其功能进行研究。主要研究内容和结果如下：一、EB病毒LMP2A基因重组逆转录病毒和稳定表达LMP2A细胞株的构建用PCR从质粒pPICZ-α／LMP2A扩增EBV的LMP2A基因片断，经EcoRⅠ、BamHⅠ酶切后定向插入含同样酶切位点的逆转录病毒表达载体pSIV-1的LTR启动子下游，构建重组逆转录病毒载体pSIV-1／LMP2A，重组质粒经PCR、EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切及序列分析鉴定。获得的重组质粒与两个辅助病毒载体pHIT456和pHIT60用脂质体共转染包装细胞293T，转化后的细胞用G418筛选，经1周筛选培养后获得抗性细胞克隆，将抗性细胞扩大培养，收集含有重组逆转录病毒颗粒抗性细胞克隆培养上清。PCR结果显示在抗性细胞克隆基因组中存在LMP2A基因。用重组逆转录病毒感染NIH3T3细胞，计算病毒滴度，并于感染后48小时用PCR、间接免疫荧光、Westem blot检测目的基因的整合和表达。结果显示，扩增到的病毒效价为5×10~5CFU／ml，PCR阳性结果提示LMP2A能整合于MH3T3细胞中，间接免疫荧光显示NIH3T3细胞有LMP2A的表达，Western blot显示在54KDa处出现特异的蛋白条带。表明重组逆转录病毒能有效地介导LMP2A基因在真核细胞中表达。用重组逆转录病毒颗粒重复3次感染L929细胞，72小时后置于含G418选择性培养基中，筛选培养2周后，获得抗性细胞克隆。PCR阳性结果提示LMP2A能整合于L929细胞中，RT-PCR结果表明LMP2A基因能转录成相应的mRNA。流式细胞仪显示91.3％的细胞能表达LMP2A，Western blot出现特异的蛋白条带。提取细胞蛋白，经His Bind Ni-NTA亲和层析柱纯化，得到纯度达90％以上的LMP2A蛋白。采用纯化的LMP2A蛋白作为抗原，用ELISA法检测EB病毒相关鼻咽癌患者血清中的抗体，结果显示鼻咽癌患者血清中存在着高滴度的抗LMP2A的抗体，检出率为72.29％。比较NPC病人LMP2A血清学检测结果与临床上VCA、EA法结果，三者检出率相当，大部分病例呈正相关，但一些病例中VCA、EA检出率低的LMP2A检出率高，而一些病例VCA、EA检出率高的LMP2A检出率低。因此，如将三者结合有助于提高鼻咽癌患者的检出率，LMP2A对鼻咽癌的检测具有辅助诊断意义。二、人外周血树突状细胞的培养鉴定及EB病毒LMP2A蛋白的负载分离EBV阳性的健康人外周血单核细胞，在含重组hGM-CSF和hIL-4的培养液中培养，用hTNF-a诱导DC成熟。共聚焦显微镜观察其形态，流式细胞仪检测细胞的表面分子。结果显示，从健康人外周血分离得到的单核细胞，体外经重组hGM-CSF、hIL-4的培养可获得未成熟的DC，流式细胞仪检测DC相对特异性标记CD1a、CD83及共刺激分子CD80、HLA-DR等表达较低，而单核细胞特异性标志CD14相对较高；当加入hTNF-α继续培养2天后，得到大量成熟DC，DC特异性标记CD1a、CD83及共刺激分子CD80、HLA-DR表达显著升高，CD14表达下调。光学显微镜下观察诱导成熟的DC具有典型树突状特征。用不同浓度的LMP2A蛋白负载未成熟的DC，诱导成熟后激光共聚焦检测DC俘获抗原的能力，FACS选择最佳蛋白负载浓度；用最佳LMP2A蛋白浓度负载未成熟的DC，FACS检测负载前后诱导成熟DC表面分子CD1a、CD83、CD14、CD80、HLA-DR变化及LMP2A表达情况；并用~3H-TdR掺入法检测负载前后诱导成熟DC刺激同种淋巴细胞增殖能力。结果显示，40μg／ml为LMP2A蛋白转染DC的最佳浓度，共聚焦和FACS结果显示约80％的DC表达LMP2A蛋白；LMP2A负载后诱导的成熟DC对细胞表面共刺激分子及特征性表面标志无影响；负载后诱导成熟DC仍具有较强的刺激同种淋巴细胞增殖能力。研究结果为蛋白负载DC免疫治疗NPC提供可能。三、EB病毒LMP2A蛋白负载树突状细胞激发特异性CTL及体外杀伤活性的研究免疫微磁珠分离获得自体CD4~+和CD8~+T细胞，FACS鉴定分选细胞纯度均大于95％。3H_TdR掺入法细胞增殖实验检测CD4~和CD8~T细胞经LMP2A蛋白负载自体DC或未负载DC刺激后的增殖水平。ELISA法检测CD4~T细胞经抗原负载后的DC刺激分泌IFN-γ和IL-10的水平。~3H-TdR掺入法结果显示，CD4~+和CD8~+T细胞经LMP2A蛋白负载自体DC刺激后的增殖水平明显高于未负载组(P＜0.001，P＜0.001)，表明DC能够俘获抗原并将抗原提呈给自体的T淋巴细胞，同时LMP2A蛋白含有MHC-Ⅰ和Ⅱ类分子限制性的靶位。ELISA法检测结果显示，CD4~+T细胞经负载后的DC刺激分泌IFN-γ明显高于未负载DC组(P=0.034)，而IL-10在各组中的分泌水平均很低。构建含有绿色荧光蛋白报告基因(GFP)荧光标记的重组逆转录病毒载体pPGEz-Term／LMP2A，与辅助病毒载体PHT 456和PHI 60共转染包装细胞293T，收集含有Zeocine的抗性细胞培养上清。用此重组逆转录病毒感染第1天诱导的未成熟DC，感染后继续在含hGM-CSF、hIL-4的培养液中培养，重复感染3次，用hTNF-α诱导DC成熟。荧光显微镜观察重组逆转录病毒转染293T细胞情况及FACS检测LMP2A在DC上的表达，并以此作为靶细胞。结果显示，荧光显微镜下观察293细胞可见绿色荧光，FACS检测出56.4％的DC能表达LMP2A。采用重复刺激技术获得LMP2A特异性CD8~+T细胞，分别以转染重组逆转录病毒pPGEZ-Term／LMP2A或空载体的自体成熟DC、LCL、K562细胞作为靶细胞，用LDH释放法检测CTL的杀伤活性。FACS检测CTL杀伤靶细胞(重组逆转录病毒pPGEZ-Term／LMP2A转染的自体成熟DC)后CD4~+和CD8~+T细胞胞内分泌细胞因子IFN-γ水平。LDH检测结果显示，LMP2A蛋白负载DC可以诱导出针对EBV-LMP2A特异的CTL，能够特异性的杀伤重组逆转录病毒pPGEZ-Term／LMP2A转染自体的成熟DC(P=0.023)。FACS结果显示，经LMP2A负载的DC诱导的特异性CD4~+和CD8~+T与靶细胞孵育后，胞内分泌细胞因子IFN-γ水平明显高于对照组(P＜0.01)。我们研究结果表明：EB病毒潜伏膜蛋白2A在L929细胞上稳定的表达，鼻咽癌患者血清中存在着高滴度的抗LMP2A的抗体；LMP2A蛋白负载的DC在体外能激发针对LMP2A特异性CTL，对重组逆转录病毒pPGEZ-Term／LMP2A转染自体的成熟DC具有杀伤效应。本研究为进一步开展EB病毒相关鼻咽癌的临床免疫治疗奠定基础，也为其它病毒相关性肿瘤的免疫治疗研究提供实验和理论依据。