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研究背景血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）是一种微血管复合结构,位于神经组织和循环血液之间。在生理情况下,BBB严格限制外周血中的物质进入中枢神经系统（Central nervous system,CNS）,以保证CNS内环境的稳定。然而,对于脑部疾病,因BBB限制了绝大部分药物进入脑实质,严重影响了CNS疾病的治疗效果。因此,如何安全有效开放BBB,协助药物递送入脑,一直是国内外学者关注的焦点。电磁脉冲（Electromagnetic pulse,EMP）是一种瞬态变化的非连续性电磁场,其特征是产生迅速、持续时间极短、峰值功率很高以及频谱范围较宽。目前,EMP已被越来越多的应用到通信工程和电子对抗中。本实验室前期研究表明,特定条件的EMP可增加BBB的通透性,且该效应与EMP的电场强度、脉宽和脉冲次数等参数有关,但发挥BBB开放作用的关键物理参数,以及该参数致BBB开放的量效关系、时效规律和敏感脑区尚不十分清楚。因此,本课题重点围绕EMP对BBB的作用规律和机制开展研究,其成果一方面为EMP开放BBB,辅助药物治疗CNS疾病的临床应用奠定基础;另一方面对制定特殊作业环境下EMP卫生防护标准、提出防治策略具有重要意义。研究目的1.明确EMP开放BBB的关键参数,并阐明该参数EMP对BBB通透性影响的量效和时效规律。2.揭示EMP开放BBB的空间分布特征。3.全面分析EMP开放BBB效应的分子机制,为EMP防护和临床应用提供理论和实验依据。研究方法1.以健康雄性SD大鼠为研究对象,参考既往文献中报道的可致BBB开放的EMP参数,设计三因素两水平析因设计实验方案。采用伊文思蓝（Evans Blue,EB）渗出定量法检测BBB通透性,比较不同电场强度（400、800 k V/m）、脉宽（40 ns、1.3μs）和脉冲次数（100次、800次）的EMP辐照对大鼠BBB通透性的影响,筛选并确定与开放BBB效应密切相关的EMP参数。2.应用白蛋白免疫组织化学染色和EB荧光显色法,观察不同电场强度（600、800、1000、1200和1500 k V/m）EMP辐照对大鼠BBB通透性的影响。通过H＆E染色、TUNEL法和Western blot,明确不同电场强度EMP对大鼠脑组织形态结构和细胞凋亡的影响。EMP其他辐照参数:脉宽40 ns、脉冲次数800次、重复频率10 Hz,辐照后3 h取材。3.应用EB荧光显色法,检测EMP辐照后不同时间（1、3、6、9、12、24 h）大鼠BBB的通透性。EMP辐照参数为:电场强度1200 k V/m、脉宽40 ns、脉冲次数800次、重复频率10 Hz。4.通过模型仿真,计算EMP辐照时大鼠脑内不同冠状平面的感应电场强度,推测BBB开放的敏感脑区。并应用EB荧光显色法、EB体外成像法验证模型仿真结果。EMP辐照参数为:电场强度1200 k V/m、脉宽40 ns、脉冲次数800次、重复频率10 Hz,辐照后3 h取材。5.通过TMT定量蛋白质组学技术全面观察和分析EMP辐照后大鼠脑皮层显著差异表达蛋白的功能,筛选与BBB结构和功能相关的关键分子。6.应用透射电镜观察、q RT-PCR、Western blot和免疫荧光染色法,观察EMP辐照后大鼠星形胶质细胞和周细胞形态、分布和功能的变化。研究结果1.电场强度是EMP开放大鼠BBB效应的主要影响因素。析因设计方差分析显示,电场强度对EMP开放大鼠BBB效应有明显影响,电场强度、脉宽、脉冲次数之间暂未发现存在交互作用。2.电场强度与EMP开放BBB效应呈正相关。结果显示,不同电场强度EMP辐照后3 h,大鼠脑组织部分微血管周围出现不同程度白蛋白和EB渗出。通过对光密度值定量分析发现,当EMP电场强度超过800 k V/m后,白蛋白和EB的渗出总量显著增加,且随着电场强度的增大渗出量有增加趋势;EMP电场强度超过1200 k V/m时,同组内发生BBB开放的个体比例最多（8/10）。提示,EMP开放BBB的效应与电场强度正相关。当电场强度为1500 k V/m时,大鼠脑组织可见明显增多的凋亡细胞。考虑到EMP的生物安全性,我们提出,1200 k V/m、40ns、800次脉冲、10 Hz重复频率是EMP开放BBB的最佳参数。3.EMP开放BBB效应是可逆的。大鼠脑组织内EB渗出总量和渗出部位光密度的分析结果显示:与sham组相比,EMP组辐照后1 h,EB渗出有增多趋势但无统计学意义;辐照后3 h,EB渗出最多且差异具有统计学意义;辐照后6 h,EB渗出明显减少;辐照后9-12 h,渗出略有增加;辐照后24 h,未观察到明显EB渗出。该结果说明:EMP致BBB通透性增加是可逆的,辐照后3 h达到峰值,辐照后24 h逐渐恢复至正常水平。4.不同脑区BBB对EMP的敏感性不同。模型仿真计算结果表明:大鼠以头部朝向脉冲源的体位暴露于EMP时,大鼠脑组织不同部位的内部电场强度不同,通过模拟计算发现,嗅球后6 mm处的脑冠状平面感应电场强度平均值最大,同一平面内,靠近外周皮层处,电场强度较大。动物实验结果表明:EMP辐照后,大鼠不同脑区EB渗出程度也不同,顶叶皮层周围（嗅球后3-9 mm范围内脑皮层）EB渗出最多,其次为前额叶皮层和海马,而纹状体和丘脑处未见明显EB渗出。该结果说明,不同脑区BBB对EMP敏感性不同;目前参数条件下,EMP辐照后大鼠顶叶皮层周围的BBB开放最明显;BBB开放的空间分布与脑内电场强度分布具有一定相关性。5.蛋白质组学结果显示,EMP辐照后大鼠脑皮层组织中515种蛋白表达差异显著,其中上调有246个,下调有269个。GO功能富集结果表明,表达差异显著的蛋白主要定位于细胞质和细胞膜,主要发挥蛋白结合的功能,参与细胞成分组装及其调控、蛋白定位、突触信号调节和顺行跨突触信号等。KEGG通路富集分析结果显示,与BBB通透性相关的紧密连接和黏附斑通路存在明显富集。6.蛋白质相互作用网络分析显示,EMP辐照后,与BBB结构和功能关系密切的差异表达蛋白有Caveolin-1、GFAP、AQP4等。7.EMP可影响星形胶质细胞和周细胞的分布和功能。EMP辐照后脑微血管周围的星形胶质细胞终足出现轻度肿胀;脑皮层GFAP表达水平无明显变化,而AQP4表达水平显著降低,在BBB渗出部位,GFAP和AQP4的分布一定程度减少。EMP辐照后周细胞形态结构无明显改变,但相关蛋白α-SMA表达增加,且主要分布在微血管和小血管。研究结论上述研究结果表明,电场强度是影响EMP开放BBB效应的关键参数,且与效应呈正相关;现条件下EMP开放大鼠BBB的最佳参数是:电场强度1200 k V/m、脉宽40 ns、脉冲次数800次、重复频率10 Hz;EMP能够可逆性开放BBB,其中大鼠顶叶皮层处BBB对EMP最敏感。EMP辐照后大鼠脑组织蛋白表达谱发生明显改变,组学分析结果和动物实验验证结果提示,EMP暴露后星形胶质细胞终足肿胀导致BBB结构完整性受损,可能参与了EMP开放BBB的过程。本论文应用交叉学科技术,通过数值模型仿真结合动物实验,揭示了大脑不同部位BBB对EMP敏感性的差异,并首次展示了EMP对大鼠脑皮层组织蛋白表达谱的影响,相关结果为EMP致BBB开放效应的应用及对作用机制的深入探讨提供了理论和实验依据。