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前言阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种慢性进行性神经退行性脑病,其典型的临床病理学改变为Aβ(β-amyloid Protein)沉积形成的老年斑,细胞内的神经元纤维缠结,海马锥体细胞颗粒空泡变性和集中在皮层和海马的神经元缺失。Aβ的神经毒性尤其是Aβ1-42致神经元凋亡机制的研究一直是AD发病机制的研究热点。目前认为Aβ引起氧化应激损伤对于AD的发生发展意义重大,研究证实Aβ可能通过激活NMDA受体而促进氧自由基的生成引起神经元损伤。线粒体对氧化应激损伤极其敏感,持续氧化损伤将迅速破坏线粒体结构和功能,可以引起更为严重的能量供应障碍,而且线粒体内膜损伤将直接导致线粒体膜电位的降低和线粒体膜通透性孔道(membrane permeability transitionpore, MPTP)的过度开放,导致细胞色素C以及其他凋亡诱导因子大量释放入胞浆,成为启动细胞凋亡的关键因素。由于线粒体在Aβ神经毒性作用机制,细胞氧化应激损伤和神经元凋亡中的重要地位,近年来它被认为是AD等神经退行性疾病治疗药物的有效作用靶点。丁基苯酞(L-3-n-butyphthalide, NBP)是从芹菜籽中提取,是我国心脑血管领域第一个拥有自主知识产权的新药,作为抗脑缺血药物,对其作用机制的研究已经比较深入,研究表明,丁基苯酞能够有效提高线粒体膜流动性,增加神经细胞线粒体ATP酶活性,稳定线粒体膜并且增加线粒体ComplexⅣ的活性。由此推测,该药对治疗以线粒体损害为关键环节或伴随有线粒体功能障碍的神经系统变性病会有所帮助。临床已有实验性的使用丁基苯酞来治疗如阿尔茨海默病,帕金森病,肌萎缩侧索硬化等一系列神经系统退行性疾病,然而丁基苯酞拮抗Aβ1-42致神经元凋亡的线粒体保护作用机制尚未得到系统阐述。目的研究β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide, Aβ1-42)致原代培养大鼠皮层神经元凋亡作用机制同时使用丁基苯酞进行干预,并且进一步探讨丁基苯酞对Aβ1-42致神经元凋亡线粒体保护作用及作用机制。方法运用细胞原代培养的方法培养皮层神经元,采用微管相关蛋白-2(MAP-2)免疫荧光化学染色进行鉴定。利用10μmol/L(终浓度)的Aβ1-42对原代培养皮层神经元进行干预建立AD细胞凋亡模型。分别采用不同浓度的NBP (0.1μmol/L, 1μmol/L,10μmol/L)预处理原代培养皮层神经元4h,继续使用10μmol/L的Aβ1-42作用24h。从而将实验细胞随机分为5个组：A组：空白对照组；B组：Aβ1-42 (10μmol/L)干预组；C组：Aβ1-42+0.1μmol/L NBP预处理干预组；D组：Aβ1-42+1μmol/L NBP干预组;E组：Aβ1-42+10μmol/L NBP干预组。Aβ1-42作用24h后采用四唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率,分光光度法检测各个处理组培养基中LDH、MDA、SOD水平,MAP-2和DAPI双染免疫荧光法染色观察细胞形态、计算凋亡细胞比率,Western Blot定量检测法检测总P38 MAPK,磷酸化p38 MAPK, Bcl-2, Bax,线粒体和胞浆中Cytc, Caspase-3, Cleaved caspase-3等线粒体凋亡途径相关蛋白的表达水平变化。结果1.Aβ1-42作用于原代培养皮层神经元24h后细胞存活率显著下降(p<0.05),神经元凋亡率显著增加(p<0.05), MDA含量和LDH活性明显增高,SOD活性明显下降(p<0.05), Bax, Capsase-3, Cleaved caspase-3,胞浆中Cytc表达增加,Bc1-2和线粒体内Cytc表达下降(p<0.05),磷酸化p38 MAPK的表达明显增加(p<0.05),总P38 MAPK的表达未见明显变化(p>0.05)。2.10μmol/L NBP预处理可以使细胞存活率明显升高(p<0.05),细胞凋亡率明显降低(p<0.05), MDA含量和LDH活性下降、SOD活性增高(p<0.05)。3.10μmol/L NBP预处理可以拮抗Aβ1-42引起的Bax, Capsase-3, Cleaved caspase-3,胞浆中Cytc表达增加,Bc1-2和线粒体内Cytc表达下降(p<0.05),同时减少磷酸化p38 MAPK的表达(p<0.05),总p38 MAPK未见明显变化。结论NBP可以抑制Aβ1-42导致的AD神经元凋亡,拮抗Aβ1-42引起引起氧化应激,通过减少氧化应激的水平和p38 MAPK的磷酸化,调节线粒体凋亡途径相关蛋白的表达发挥保护作用抑制AD神经元凋亡。