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本研究通过固定化黑曲霉生物转化制备得到发酵液,其中含有未完全反应的底物单宁酸、产物没食子酸、残留的培养基成分及菌体蛋白等。本研究根据发酵液的组成成分及其特性制定了详细的没食子酸分离纯化工艺路线:确定了当发酵液同时存在没食子酸及单宁酸时高效液相色谱检测方法;对发酵液回流方式进行了探索;对树脂法分离纯化没食子酸的工艺进行了优化并对膜分离方法分离纯化没食子酸进行初探。获得以下结论:(1)发酵液中单宁酸与没食子酸共存时,确定其检测方法:采用紫外分光光度法测定没食子酸及单宁酸时,没食子酸和单宁酸在260 nm到280 nm都有很大的吸收峰,当两者同时存在于溶液中时,利用紫外分光光度计测定两种物质会有互相干扰,故采用紫外分光光度法测定单宁酸会造成很大误差。本研究采用高效液相色谱法对没食子酸及单宁酸进行检测,并确定了两种色谱条件。两种色谱条件为:(1)色谱柱:VP-ODS(150 mm×4.6 mm),流动相配比:A:B:D=55%水:30%甲醇:15%(0.5%冰乙酸),流速:1 ml·min-1,进样量:20μl,柱温:30℃,检测波长:264 nm。(2)色谱柱:VP-ODS(150 mm×4.6 mm),流动相配比:A:B:D=20%水:65%甲醇:15%(0.5%冰乙酸),流速:0.8 ml·min-1,进样量:20μl,柱温:30℃,检测波长:275 nm。两种色谱条件稳定性良好、准确度及灵敏度高。(2)对发酵液回流方式进行探索:本实验通过对比使单宁酸含量恒定和没食子酸含量恒定两种方式对发酵液进行回流,发现通过使没食子酸含量恒定,降低单宁酸的投加量可以有效的降低成本;发酵液按100%的比例进行回流,相同操作重复发酵6批次。单宁酸总添加量为708 g·L-1,单宁酸总转化率达到91.97%,没食子酸总产率达到89.68%,残留单宁酸浓度从65.46 g·L-1降至18.31 g·L-1。(3)树脂的选取:本实验通过对几种树脂静态吸附的研究,确定了采用分步法对没食子酸进行分离纯化,即发酵液先经树脂XDA-7处理再经A-722MP处理。其中XDA-7树脂用来吸附单宁酸,A-722MP树脂用来吸附没食子酸。此种方法优势在于可以分步回收单宁酸和没食子酸。(4)分别对XDA-7树脂和A-722MP树脂分离纯化工艺进行优化:XDA-7树脂分离纯化没食子酸的工艺条件,通过单因素和响应面优化,得到单因素优化结果与响应面优化结果一致,最佳吸附工艺条件为:没食子酸浓度为2 g·L-1、溶液pH为5、液固比为10:1、上样速度为2.0 BV·h-1。此条件下没食子酸吸附率为16.51%,单宁酸吸附率为97.18%。发酵液经XDA-7树脂处理后再经A-722MP树脂处理。A-722MP树脂分离纯化没食子酸的工艺条件,通过单因素和响应面优化,得到单因素优化结果与响应面优化结果一致,最佳吸附工艺条件为:没食子酸浓度为2 g·L-1、溶液pH为6、液固比为5:1、上样速度为2.0 BV·h-1。此条件下没食子酸吸附率为99.03%。最佳洗脱条件为:最佳上样速度为2.0 BV·h-1;最佳NaCl浓度为10%;最佳液固比为25:1。此条件下没食子酸洗脱率为89.52%。最终没食子酸得率为88.65%,纯度从85.95%提高至97.26%。并且树脂XDA-7和A-722MP重复使用效果良好。(5)对膜分离方法进行初探得到:截留分子量为300及1000的膜对没食子酸的分离纯化有显著效果。